Особенности репродукции ДНК- и РНК- вирусов.

Репродукция -РНК-вирусов - У него РНК фрагментарная. Поступает в кл. слиянием мембран. Выход РНК-, кот. ничего не умеет делать. Образуется РНК+, кот. идет в рибосомы, образуются структурные и не структурные белки это 1-е направление. 2-е направление: с помощью клеточной полимеразы где учавствует клеточная РНК-полимераза из + будут строится “-“ нити. Сборка. Отпочкование. Возможны мутации: где образуются с “-“ на + и идет из хромосом образуются ДНК полимеразы.

Репродукция +РНК-вирусов - выполняет функцию информационной, матричной, транспортной. Сначало адсорбция, виролексис (то же самое что ДНК), депротонизация высвобождается РНК+, которые идут к рибосомам и образуется длинные полипептидные нити. Протеазы делают их короткими. А другое направление: на матрице + образуются “ – “ (минус) это репликативная форма становится двунитчатой + и “– “ и с “ –“ идет репликация на + ниточек. Короткие нити идут в рибосомы образуется РНК-полимераза идет синтез белковых структур. Идет сборка. Уходят через мембрану, испорченную М-белками. Ретровирусы (ВИЧ, онкогенные вир.) имеют фермент обратную транскриптазу. Она +. Обладают способностью встраиватся в хромосому клетки хозяина. РНК превращается в ДНК. Вирус попал в клетку путем слияния мембран, освобождается РНК+ (обратная транскриптаза), каторая на матрице РНК строит ДНК (минусовую). Клетка достраивает ДНК нормальную, которая направляется в ядро и клеточные ферменты разрезают и встраивают вирусную ДНК в хромосом клетки. Клеточные ферменты образуют РНК+, матричную вир. РНК и в рибосомах идёт синтез белковых структур (М, структурные и не структурные белков, шипы). Выход почкованием и захват кл. мембраны (фрагменты).

Репродукция ДНК-вирусов. Проникает путем виропексиса. Ранняя стадия - вирусная ДНК проникает в кл, тренскрибируерся РНК-полимеразой. Считывается => транслируется часть вирусного генома => синтезируется «ранние белки». Поздняя стадия - синтез нуклеиновых кислот вируса. Вирусная ДНК упаковывается в вирионы дочерней популяции. Часть ДНК на синтез «поздних белков».

48. Типы взаимодействия вирусов с клеткой: продуктивный, абортивный, интегративный.

Известны три типа взаимодействия вируса с клеткой:

1) продуктивный ти п, завершающийся образованием вирусного потомства;

2) абортивный тип, не завершающийся образованием новых вирусных частиц, поскольку инфекционный процесс прерывается на одном из этапов;

3) интегративный тип(или вирогения), характеризующийся встраиванием вирусной ДНК в хромосому клетки-хозяина.

ПРОДУКТИВНЫЙ ТИП взаимодействия (репродукция вирусов) осуществляется в несколько стадий, последовательно сменяющих друг друга:

1. Адсорбция вируса на клетке, т.е. прикрепление вирусов к поверхности клетки. Вирус адсорбируется на клеточных рецепторах разной химической природы (белки, углеводные компоненты белков и липидов, липиды), число которых на поверхности одной клетки колеблется между 10⁴ и 10⁵. Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц. Поверхностные структуры вируса, узнающие специфические клеточные рецепторы и взаимодействующие с ними, называются прикрепительными белками. Обычно эту функцию выполняет один из поверхностных белков капсида или суперкапсида. Соответствие (комплементарность) клеточных рецепторов вирусным прикрепительным белкам определяет возможность возникновения инфекционного процесса в клетке; от этого зависят спектр клеток, поражаемых вирусом, или его тропизм, и в ряде случаев, чувствительность организма к данному вирусу.

2. Проникновение вируса в клетку: существует два способа проникновения вирусов животных в клетку: виропексис и слияниевирусной оболочки с клеточной мембраной.

При виропексисе, после адсорбции вирусов, происходит инвагинация (впячивание) участка клеточной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, которая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транспортироваться в любом направлении в разные участки цитоплазмы или ядро клетки.

Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочек.

По-видимому, оба механизма проникновения вируса в клетку не исключают, а дополняют друг друга.

3. «Раздевание» вируса: процесс заключается в удалении защитных вирусных оболочек и освобождении внутреннего компонента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. «Раздевание» вирусов происходит постепенно, в несколько этапов, а конечными продуктами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нуклеиновая кислота.

4. Б иосинтез компонентов вируса; проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генети-ческой информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирусные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение вирусного потомства.

Синтез компонентов вируса (белков и нуклеиновых кислот) разобщен во времени и пространстве, т.е. протекает в разных структурах ядра и цитоплазмы клетки. Вот почему этот уникальный способ размножения вирусов называется дизъюнктивным (разобщенным).

5. Ф ормирование (сборка) вирионов: синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью специфически узнавать друг друга и при достаточной их концентрации самопроизвольно соединяются в результате гидрофобных, солевых и водородных связей. Сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодействии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, с которыми взаимодейст-вуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа). Формирование вирусов происходит на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки.

6. В ыход вирусов из клетки: различают 2 основных типа выхода вирусного потомства из клетки:

а ) взрывной - характеризуется одновременным выходом большого количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой тип выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсида.

б) почкование - он присущ вирусам, имеющим суперкапсид. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячивания образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «почка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки. При таком механизме клетка может продолжительное время продуцировать вирус, сохраняя в той или иной мере свои основные функции.

Время, необходимое для осуществления полного цикла репродукции вирусов, варьирует от 5-6 часов (вирусы гриппа, натуральной оспы) до нескольких суток (вирусы кори, аденовирусы). Образовавшиеся вирусы способны инфицировать новые клетки и проходить в них указанный выше цикл репродукции.

ИНТЕГРАТИВНЫЙ ТИП ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ (ВИРОГЕНИЯ) характеризуется встраиванием (интеграцией) нуклеиновой кислоты вируса в хромосому клетки. При этом вирусный геном реплицируется и функционирует как составная часть клеточного генома.

Интеграция вирусного генетического материала с ДНК клетки характерна для определенных групп вирусов: бактериофагов, онкогенных (опухолеродных) вирусов, вируса гепатита В, вирус герпеса, ВИЧ.

Для интеграции с хромосомой клетки необходима кольцевая форма двунитчатой вирусной ДНК. У ДНК-содержащих вирусов (вирус гепатита В) их ДНК обладает свойством встраиваться в геном клетки при участии ряда ферментов. У некоторых РНК-содержащих вирусов (ВИЧ, онкогенные вирусы) сначала на матрице РНК с помощью вирусспецифического фермента синтезируется ДНК-копия, которая затем встраивается в ДНК клетки. ДНК вируса, находящаяся в составе хромосомы клетки, называется ДНК-провирусом.

При делении клетки, сохраняющей свои нормальные функции, ДНК-провирус переходит в геном дочерних клеток, т.е. состояние вирогении наследуется. ДНК-провирус несет дополнительную генетическую информацию, в результате чего клетка приобретает ряд новых свойств. Так, интеграция может явиться причиной возникновения ряда аутоиммунных и хронических заболеваний, разнообразных опухолей. Под воздействием ряда физических и химических факторов ДНК-провирус может вырезаться из клеточной хромосомы и переходить в автономное состояние, включаясь в обычный цикл репродукции.

49. Классификация клеточных культур, применяемых в вирусологии.

Культура клеток - это клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro). Культуру клеток можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона), лучше - из эмбриональных органов, так как клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для этих целей используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных.

Культуры клеток - наиболее совершенная из лабораторных система для культивирования вирусов. В вирусологической практике культуры клеток чаше всего используют для:

- первичного обнаружения вирусов и их выделения из патологического материала; - накопления вируса при изготовлении вакцин и диагностикумов, поддержания вирусных штаммов в лаборатории;

- титрования вирусов;

- как тест-объект в реакции нейтрализации

Типы клеточных культур.

1.Первичные (трипсинизированные) культуры- фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных и т.д. Первичные культуры получают из клеток различных тканей чаще путем их размельчения и трипсинизации, используют однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.

2.Линии диплоидных клеток пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило не более 20 пассажей (теряют исходные свойства).

3.Перевиваемые линии (гетероплоидные культуры), способны к многократному диспергированию и перевиванию, т.е. к многократным пассажам, наиболее удобны в вирусологической работе- например, линии опухолевых клеток Hela, Hep и др.

50. Методы заражения куриного эмбриона. Цель. Этапы.

Куриный эмбрион используется для культивирования вирусов, микоплазм. Используют эмбрионы в возрасте 8-14 дней в зависимости от вида вируса и способа заражения; на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную и ам-ниотическую полость, в желточный мешок. Перед-заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушного мешка. Заражение куриных эмбрионов производят в боксе в строго асептических условиях, пользуясь инструментом, стерилизованным кипячением. Скорлупу над воздушным пространством протирают спиртом, об­жигают в пламени, смазывают 2% раствором йода, снова протирают спиртом и обжигают. Вирусный материал в количестве 0.05 — 0.2 мл наносят на хорион-аллантоисную оболочку туберкулиновым шприцом или пастеровской пипеткой.

Вскрытие эмбрионов производят через 48 — 72 часа инкубации в термоста­те. Наличие вируса в хролантоиской оболочке определяют:

1. По белесоватым непрозрачным пятнам разной формы;

2. В реакции гемаглютинации.

Для заражения в хорион-аллантоисную оболочку наиболее пригодны 12-дневные эмбрионы.

Яйцо берут в левую руку и скорлупу срезают изогнутыми ножницами несколько выше границы воздушного пространства. Пинцетом осторожно снимают часть подскорлупной оболочки, обнажая лежащую под ней хорион- аллантоисную оболочку. Исследуемый материал наносят на хорион-аллантоисную оболочку в объеме 0,1-0,2 мл.отверстие в скорлупе закрывают стерильным стеклянным колпачком или покровным стеклом и заливают расплавленным парафином. На боковой поверхности зараженных яиц пишут дату заражения, название материала и его дозу.

1.Определяем воздушное пространство в овоскопе

2.Обработка скорлупы(спирт, йод, спирт, обжиг)

3.Дыроколом проделываем отверстие в скорлупе

4.Пастеровской пипеткой наносим исследуемый материал 0,1 мл на хорион-аллантоисную оболочку.

Отверстие в скорлупе можно заклеить лейкопластырем. Вскрыть через 48-72 часа.

Дата добавления: 2017-02-01