Использование бактериофагов в микробиологии и медицине. Реакции фаготипирования и фаголизиса

Методы получения бактериофагов. Индикация и титрование фагов (по Грациа и Аппельману).

Метод титрования бактериофага по Аппельману
(на жидкой питательной среде)

Готовят десятикратные разведения исследуемого бактериофага в питательном бульоне. Для этого в ряд пробирок разливают по 4,5 мл бульона. В 1-ю пробирку добавляют 0,5 мл исследуемого фага. Тщательно перемешивают и переносят в последующие пробирки (из пробирки в пробирку) по 0,5 мл соответствующего разведения фага с уменьшением его концентрации в десять раз. Получают разведения от 10^-1 до 10^-9 степени. Затем в пробирки вносят по 1 капле суточной культуры соответствующих бактерий. После инкубации в течение суток определяют титр фага. За титр бактериофага принимают то его максимальное разведение, при котором наблюдается полный лизис культуры (просветление среды).

Метод титрования бактериофага по Грациа
(на плотной питательной среде)

Питательный агар разливают в чашки Петри и подсушивают в термостате. Готовят полужидкий питательный агар по 3–4 мл в пробирке и растапливают его на водяной бане. Делают десятикратные разведения исследуемого бактериофага в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл каждого разведения бактериофага смешивают с таким же объёмом суточной бульонной культуры чувствительных к бактериофагу бактерий и выливают эту смесь в пробирку с полужидким агаром температурой 45°C. Приготовленную смесь быстро выливают на поверхность первого слоя агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37°C в течение суток. Смеси бактериофага, культуры и полужидкого агара делают из разведений фага 10²–10¹⁰, в зависимости от предполагаемого титра фага.

Не заражённые бактериофагом бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности питательного агара. Каждая инфицированная бактериофагом бактерия лизируется и освобождает потомство бактериофага, которое внедряется в интактные клетки бактерий, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются «стерильные» пятна или негативные колонии бактериофага. Число этих пятен соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии бактериофага называется его титром.

Препараты фагов применяют для лечения и профилактики инфекционных болезней, а также в диагностике — для определения фагочувствительности и фаготипироваиия при идентификации микроорганизмов.

В Советском Союзе выпускались следующие препараты, используемые для лечения и профилактики заболеваний: брюшнотифозный, сальмопеллезный, дизентерийиныи, колифаг, стафилококковый фаг и стрептококковый. В настоящее время фаги применяют для лечения и профилактики в сочетании с антибиотиками. Такое применение оказывает более эффективное действие на антибиотикоустойчивые формы бактерий.

Диагностические бактериофаги широко применяются для идентификации бактерий, выделенных от больного или из инфицированных объектов внешней среды. С помощью бактериофагов вследствие их высокой специфичности можно определить виды бактерий и с большей точностью отдельные типы выделенных бактерий. В настоящее время разработаны фагодиагностика и фаготипирование бактерий рода Salmonella, Vibrio и стафилококков. Фаготипирование помогает устанавливать источник инфекции, изучать эпидемиологические связи, отличать спорадические случаи заболеваний от эпидемических.
В основе фагодиагностики и фаготипирования лежит принцип совместного культивирования выделенного микроорганизма с соответствующими видовыми или типовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с видовым, а затем с одним из типовых фагов.

Применение фагов:

1.Для диагностики: заключается в выделении фага из организма больного, что косвенно свидетельствует о наличии в материале соответствующих микробов.

2.Для фагоидентификации бактериальных культур с целью установления их видовой принадлежности.

3.Для фаготипирования бактерий, т.е. для определения фаговара по лизису штаммов бактерий одного и того же вида типоспецифическими фагами, что важно для маркировки исследованных культур при эпидемиологическом анализе заболеваний.

4.Для фаготерапии-лечение некоторых инфекционных заболеваний.

5.Для фагопрофилактики.

Определение фаготипа стафилококка.

Цель: Определить внутрибольничное заражение при циркуляции микроба, идентификация.

Ход: чашку Петри расчерчивают на 22 квадрата, по числу фагов. Проводят посев культуры стафилококка, в каждый квадрат закапывают по 1 капле соответствующего фага. Чашку инкубируют в термостате. На 2ой день учет результатов.

Реакция фаголизиса Шигелл.

2 пробирки с МПБ: опытная и контрольная.

Чистая культура шигелл-дизентерийный бактериофаг.

1.Проверка культуры на чистоту(мазки, окраска по граму)

2.Производят посев культуры Шигелл в пробирки.

3.В пробирку «опыт» добавляют 2 капли дизентерийного фага.

Пробирки инкубируют в термостате.

2 этап: Чтение результатов посева.

Дата добавления: 2017-02-01