Определение концентрации гемоглобина

Опыт № 2 Экспериментальная постгеморрагическая анемия у кролика

Опыт № 1 Экспериментальная гемолитическая анемия у кролика

За 3-4 дня до опыта в течение 3-х дней под кожу спины кролика вводят 3% раствор солянокислого фенилгидразина из расчета 0,5 мл на 1 кг веса, в результате чего у животного развивается гемолитическая анемия.

В крови, взятой из краевой вены уха, определяют количество эритроцитов в 1 л, содержание гемоглобина, вычисляют цветовой показатель и готовят мазки для изучения морфологии эритроцитов и подсчета ретикулоцитов.

За 2-3 дня до опыта у кролика вызывают острую постгеморрагическую анемию путем кровопускания 30-40% объема крови.

В крови, взятой из краевой вены уха, изучают те же гематологические показатели, что и в опыте №1.

Методика подсчета количества эритроцитов

А. Кровь из уха кролика набирают в эритроцитарный меланжер до метки 0,5 и разводят в 200 раз 2% раствором поваренной соли (до метки 101). После тщательного встряхивания меланжера заполняют счетную камеру и производят подсчет эритроцитов по известным правилам.

Б. В предварительно высушенную чистую пробирку точно отмеривают пипеткой 4 мл 2% раствора поваренной соли. Осторожно выдувают в неё 0,02 мл крови, взятой из краевой вены уха кролика (кровь забирают пипеткой от гемометра Сали). Взвесь тщательно перемешивают и заполняют ею камеру.

Для вычисления количества эритроцитов в 1 л пользуются формулой:

,

где: А – число сосчитанных эритроцитов,

80 – количество малых квадратов, в которых считали эритроциты,

1/4000 – объем камеры над малым квадратом сетки Горяева в мкл,

200 – разведение крови в смесителе.

А. Унифицированный цианметгемоглобиновый метод. В основе метода лежит окисление гемоглобина железосинеродистым калием (красной кровя­ной солью) в метгемоглобин, который с ацетонциангидрином образует окрашен­ный цианметгемоглобин. Метод позволяет суммарно определить все разновидности гемоглобина за исключением сульфгемоглобина.

Для исследования в пробирку берут 5,0 мл трансформирующегораствора, содержащего указан­ные реактивы (железосинеродистый калий и ацетонангидрид) и добавляют 0,02 мл крови. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин. Измерения проводят на спектрофотометре при длине волны 540 нм или фотоэлектрокалориметре при длине волны 520-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с длиной оптического пути 10 мм против холостой пробы (трансформирующий раствор).

Б. Гематиновый метод (метод Сали). Определение проводят в гемометре Сали. Этот прибор состоит из штатива, в котором по бокам располагаются запаянные пробирки с цветной стандартной жидкостью, а в середине находится открытая сверху градуированная стеклянная пробирка, показывающая количество гемоглобина в г/л (норма для человека 166,7 г/л)

Для определения в градуированную пробирку наливают 0,1N раствор соляной кислоты до нижней круговой метки. Затем набирают кровь в капиллярную пипетку до метки, т.е. в объеме 0,02 мл, и осторожно выдувают на дно градуированной пробирки гемометра. Пробирку несколько раз встряхивают и, заметив время, ставят в штатив на 5 минут для полного превращения гемоглобина в хлорид гематина. Через 5 минут гемометр поднимают до уровня глаз и сравнивают цвет испытуемой жидкости с цветом стандартов (обычно он темнее, чем в стандартных пробирках). С помощью пипетки к испытуемому раствору приливают по каплям дистиллированную воду и перемешивают стеклянной палочкой до тех пор, пока цвет испытуемой жидкости полностью не сравняется с цветом стандарта, отмечая при этом, какому делению шкалы соответствует уровень жидкости.

Вычисление цветового показателя

Цветовой показатель вычисляется по формуле:

ЦП=	Найденное количество гемоглобина (г/л)	:	Найденное количество эритроцитов (в 1 л)
166,7 г/л	5·10^12/л

или

ЦП=	3·Нв (г/л)
3 первые цифры числа эритроцитов (в млн)

Метод прижизненной (суправитальной) окраски

ретикулоцитов бриллиант-крезилблау

Каплю краски (бриллиант-крезилблау) наносят стеклянной палочкой на предварительно хорошо вымытое, обезжиренное и подогретое над пламенем горелки стекло и делают мазок тонким шлифованным стеклом. Краска быстро высыхает. Такие стекла можно заготовить впрок.

На приготовленное таким образом стекло наносят каплю крови, делают тонкий мазок и тотчас же помещают во влажную камеру. Для этого удобно пользоваться чашкой Петри с крышкой, на дно которой кладут влажный бумажный фильтр.

Во влажной камере мазки выдерживают 5-8 минут, затем высушивают на воздухе, рассматривают с помощью иммерсионной системы микроскопа. Эритроциты и ретикулоциты при этом методе окраски красятся в зеленовато-голубоватый цвет, в отличие от окраски по Романовского-Гимза, где эритроциты красятся в розовый цвет, а ретикулоциты вообще не выявляются. Ретикулоциты отличаются от зрелых эритроцитов наличием окрашенной в синий цвет зернисто-сетчатой субстанции. Для подсчета ретикулоцитов поле зрения микроскопа ограничивают бумажным окошечком. В мазке сосчитывают 1000 эритроцитов и определяют приходящееся на это число количество ретикулоцитов, которое выражают в промилле (‰).

Приготовление окрашенного мазка для изучения

морфологии эритроцитов

На предметное стекло наносят тонкий мазок крови, который после высыхания фиксируют в метиловом спирте 3 минуты или в смеси Никифорова 20 минут. Мазок заливают краской Романовского и через 25‑30 минут смывают краску водопроводной водой; после высушивания мазок рассматривают с помощью иммерсионной системы микроскопа.

В мазке крови обратить внимание на величину и форму эритроцитов, степень насыщенности их гемоглобином, наличие патологических форм.

Все гематологические показатели, полученные у обоих кроликов, объединить в одной таблице, сопоставить их, объяснить различия в картине периферической крови при гемолитической и постгеморрагической анемии.

Дата добавления: 2017-02-01