Общие сведения. Методы получения витаминов

Производство Витаминов микробиологическим способом

Витамины - группа низкомолекулярных органических веществ, которые в очень низких концентрациях оказывают сильное и разнообразное биологическое действие. В природе источниками витаминов являются главным образом растения и микроорганизмы. Менахиноны и кобаламины синтезируются исключительно микроорганизмами. И хотя химический синтез в производстве большей части витаминов занимает ведущее положение, микробиологические методы также имеют большое практическое значение. Микробиологическим путем получают эргостерин, витамин В_12, B, D. Кроме того, микроорганизмы используются как селективные окислители сорбита в сорбозу (при получении витамина С), а также для производства витаминных концентратов (витамина В₂, каротиноидов). Перспективно микробиологическое получение биотина, используемого в рационе кур и свиней.

В мире существует 40 крупных промышленных производителей витаминов; 18 из них - в США, 8 - в Японии, 14 - в Западной Европе. Ведущее место в производстве витаминов занимает швейцарский концерн Hoffman La Roche, выпускающий 50 - 70 % всех витаминов от мирового европейского производства.

Получение витамина В₁₂

Среди неполимерных соединений витамин В₁₂ имеет самое сложное строение. Это α (5,6-диметилбензимидазол) - кобамидцианид или цианкобаламин. ( рисунок 36 )

В молекуле витамина В₁₂ различают: порфириноподобное, хромофорное или корриновое кольцо, связанное с атомом кобальта четырьмя координационными связями через атомы азота.

Верхним координационным лигандом кобальта в витамине В₁₂ является цианогруппа. Ее место могут занимать другие неорганические или органические заместители, например, NO₂^2- SO₂^2-, ОН^-, Н₂О, СН₃, аденозил; заместители определяют название производных витамина В₁₂.

Шестая позиция кобальта занята нуклеотидным ядром (нижним лигандом кобальта), состоящим из азотистого основания, рибозы и
остатка фосфорной кислоты.

Нуклеотидное ядро связано с кобальтом через азот основания, а с корриновым кольцом - через аминопропаноловый мостик.

  Рисунок 36 - Структура цианкобаламина.

В составе витамина В₁₂ или цианкобаламина азотистое основание представлено 5,6-диметилбензимидазолом (5,6-ДМБ). Наличие 5,6-ДМБ определяет активность молекулы корриноидов (синоним названия витаминов группы В₁₂) для высших животных. Вместо 5,6-ДМБ микроорганизмы могут включать в молекулу другие бензимидазольные и пуриновые основания. Нуклеотидное ядро вообще может отсутствовать, как в случае фактора В. Через 25 лет после открытия витамина B₁₂ в 1972 г. в результате многолетних исследований был осуществлен полный химический синтез корриноидной структуры. Корриноид синтезирован в результате тридцати семи последовательных ступеней, но в силу сложности такого синтеза микробиологический метод остается пока единственным промышленным способом получения витамина В₁₂.

Продуценты витамина B_{12 .}

В природе витамин В₁₂ и родственные корриноидные соединения находят в клетках микроорганизмов, в тканях животных и некоторых высших растениях (горох, лотос, побеги бамбука, листья и стручки фасоли). Однако происхождение витамина В₁₂ в высших растениях окончательно не установлено. Такие низшие эукариоты, как дрожжи и мицелиальные грибы, корриноиды, по-видимому, не образуют. Организм животных не способен к самостоятельному синтезу витамина. Среди прокариот способность к биосинтезу корриноидов широко распространена. Активно продуцируют витамин В₁₂ представители рода Propionibacterium. Природные штаммы пропионовокислых бактерий образуют 1,0—8,5 мг/л корриноидов, но получен мутант P. shermanii M.- 82, с помощью которого получают до 58 мг/л витамина. В семействе Propionibacteriaceae есть и другие представители, способные к высокому накоплению витаминами В₁₂ в клетках. Это, прежде всего, Eubacterium limosum (Batyribacterium retteerii). Как продуценты витамина практический интерес имеют многие представители актиномицетов и родственных микроорганизмов. Истинный витамин В₁₂ в значительных количествах синтезирует Nocardia rugosa. Путем мутаций и отбора получен штамм N. rugosa, накапливающий до 18 мг/л витамина В₁₂. Активные продуценты витамина обнаружены среди представителей рода Micromonospora: M. purpureae, M. echinospora, M. halophitica, M. fusca, M. chalceae.

Высокой кобаламинсинтезирующей активностью обладают метаногенные бактерии, например, Methanosarcina barkeri, M. vacuolata и отдельные штаммы галофильного вида Methanococcus halophilus. Последний организм синтезирует более 16 мг корриноидов на грамм биомассы. Столь высокого содержания корриноидов не отмечено ни у одного другого из изученных микроорганизмов. Причина высокого содержания корриноидов у метаногенных бактерий не установлена. Корриноиды синтезируют строго анаэробные бактерии из рода клостридий. У Clostridium tetanomorphum и Cl. Sticklandii аденозилкобаламин входит в состав ферментных систем, катализирующих специфические реакции изомеризации таких аминокислот, как глутаминовая, лизин и орнитин. В значительных количествах образуют витамин В₁₂ ацетогенные клостридии Cl. thermoaceticum, Cl. formicoaceticum и Acetobacter woodi, синтезирующие ацетат из СО₂. Известны активные продуценты витамина B₁₂ у псевдомонад, среди которых лучше других изучен штамм Pseudomonas denitrificans MB-2436 - мутант, дающий на оптимизированной среде до 59 мг/л корриноидов. Корриноиды синтезируют Rhodopseudomonas, фототрофные пурпурные бактерии Rhodobacter sphericus, Rh. Capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Chromatium vinosum и ряд других видов. Наряду с витамином В₁₂ они образуют бескобальтовые корриноиды, роль которых для продуцентов не установлена. Значительные количества витамина В₁₂ образует цианобактерия Anabaena cylindrica, одноклеточные зеленые водоросли Chlorella pyrenoidosae и красные водоросли Rhodosorus marinus. Продуценты витамина B₁₂ культивируют в средах, приготовленных на основе пищевого сырья: соевой муки, рыбной муки, мясного и кукурузного экстракта. В последние годы выявлены микроорганизмы, образующие высокие качества корриноидов при утилизации непищевого сырья.

Получение и применение витамина В₁₂

Мировая продукция витамина В₁₂ составляет 9 - 11 тыс. кг в год; из них 6,5 тыс кг используют на медицинские цели, а остальное - для животноводства. Производство витамина В₁₂ основано главным образом на культивировании пропионовокислых бактерий (Великобритании, Венгрии), мезофильных и термофильных меганогенных бактерий (Венгрия), а также актиномицетов и родственных форм (Италия).

В СНГ в качестве продуцента витамина В₁₂ используют Propionibacterium freudenreichii var. shermanii. Для получения витамина B₁₂ бактерии культивируют периодическим методом в анаэробных условиях в среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, соли кобальта и сульфат аммония. Образующиеся в процессе брожения кислоты нейтрализуют раствором щелочи, который непрерывно поступает в ферментер. Через 72 ч. в среду вносят предшественник - 5,6-ДМБ. Без искусственного введения 5,6-ДМБ бактерии синтезируют фактор В и псевдовитамин В₁₂ (азотистым основанием служит аденин), не имеющие клинического значения. Ферментацию заканчивают через 72 ч. Витамин B₁₂ сохраняется в клетках бактерий. Поэтому после окончания брожения биомассу сепарируют и экстрагируют из нее витамин водой, подкисленной до рН 4,5 - 5,0 при 85 - 90°С в течение 60 мин. с добавлением в качестве стабилизатора 0,25 % NaNO₂.

Водный раствор витамина В₁₂охлаждают, доводят рН до 6,8 - 7,0 50 %-ным раствором NaOH. К раствору добавляют Al₂(SO₄)₃* 18Н₂О и безводный FeCl₃ для коагуляции белков и фильтруют через фильтр - пресс. Очистку раствора проводят на ионообменной смоле СГ-1,с которой кобаламины элюируют раствором аммиака. Далее проводят дополнительную очистку водного раствора витамина органическими растворителями, упаривание и очистку на колонке с А1₂О₃, с окиси алюминия кобаламины элюируют водным ацетоном. К водно-ацетоновому раствору витамина добавляют ацетон и выдерживают 24 - 48 ч. при 3 - 4°С. Выпадающие кристаллы витамина отфильтровывают, промывают сухим ацетоном и серным эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над Р₂О₅. Для предотвращения разложения В₁₂ все операции необходимо проводить в сильно затемненных помещениях или при красном свете. Таким образом можно получить не только смесь CN- и оксикобаламинов, но и коферментную форму, которая обладает высоким терапевтическим эффектом.

Промышленность выпускает различные формы лечебных препаратов кобаламинов: ампулы со стерильным раствором CN – B₁₂, приготовленного на 0,9 % растворе NaCl, таблетки CN - В₁₂ и в смеси с фолиевой кислотой, таблетки, (муковита), содержащие CN - B₁₂ и мукопротеид. Лечебные препараты в ампулах: камполон, антианемин и гепавит содержат водный экстракт печени крупного рогатого скота. Перспективны исследования по мутагенезу пропионовокислых бактерий как один из способов повышения продуктивности штамма, а также проверки и внедрения в производственные условия других продуцентов, растущих на дешевом непищевом сырье.

Промышленное получение витамина В₁₂ с помощью пропионовокислых бактерий позволяет полностью удовлетворить потребности медицины. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином В₁₂ используют пропионовокислые бактерии как в чистом виде, так и в виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке. Для нужд животноводства витамин В₁₂ получают, используя смешанную культуру, содержащую термофильные метанообразующие бактерии.

Установлено образование корриноидов не только в смешанной, но и в чистой культуре метанобразующих бактерий Methanosarcina barkeri, Methanobacterium formicum при росте в присутствии Н₂ и СО₂. Содержание корриноидов у метанобразующих бактерий составляет 1,0 - 6,5 мг/г сухой биомассы. С помощью смешанной культуры метанобразующих бактерий разработан метод получения кормового препарата витамина В₁₂ - КМБ₁₂. Субстратом для метанового брожения служит ацетоно-бутиловая и спиртовая барда. Ацетоно-бутиловую барду получают в результате удаления растворителей из культуральной жидкости Clostridium acetobutylicum, сбраживающей паточно-мучные заторы. Для метанового брожения используют декантат барды, содержащий 2,0 - 2,5 % сухих веществ. К декантированной барде добавляют 4 г/м³ СоС1₂ и 0,5 % метанола как стимуляторов синтеза кобаламинов. В качестве биостимуляторов вносят также карбамид и диаммонийфосфат, 5,6-ДМБ не вносят, поскольку CN= B₁₂ и фактор III, обладающие биологической активностью, составляют до 80 % от суммы всех корриноидов.

Исходная барда имеет температуру около 100°С и практически стерильна. Перед поступлением в ферментеры барда охлаждается до 55 - 57°С. В качестве исходной культуры используют смешанную культуру метанообразующих бактерий, осуществляющих термофильное метановое брожение сточных вод. Получение концентрата витамина В₁₂ включает следующие технологические стадии: непрерывное сбраживание барды комплексом бактерий, сгущение метановой бражки и сушку сгущенной массы на распылительной сушилке. Брожение проводят в железобетонных ферментерах непрерывным способом в течение года.

Важное условие нормального процесса брожения - контроль уровня жирных кислот и аммонийного азота. Витамин В₁₂ неустойчив при тепловой обработке, особенно в щелочной среде. Поэтому перед выпариванием к метановой бражке добавляют НСl до оптимального значения рН 5,0 - 5,3 и сульфит (оптимальное содержание 0,07 - 0,1 %). Перед поступлением на установку выпаривания метановая бражка дегазируется путем нагревания до 90 - 95°С при атмосферном давлении. Бражку сгущают до 20% сухих веществ в четырехкорпусных выпарных аппаратах. Сгущенная метановая бражка высушивается на распылительной сушилке.

Сухой концентрат КМБ-12, помимо витамина В₁₂ (100 мг/кг препарата), содержит ряд других ростстимулирующих веществ. Особенно хорошие результаты в животноводстве получают при сочетании витамина В₁₂ с малыми дозами антибиотиков, в частности, с биомицином.

Получение витамина В₂

Рибофлавин (витамин В₂, 7,8-диметил-10-(1-D-рибитил-изоаллоксазин) выделен в кристаллическом виде в 1933 г. В основе строения флавинов, к которым относится рибофлавин, лежит гетероциклическая изоаллоксазиновая система, представленная тремя конденсированными циклами: ароматическим (А), пиразиновым (В) и пиримидиновым (С). К азоту пиразинового кольца присоединен спирт рибит.

Рибофлавин функционирует в коэнзимных формах, представляющих собой его фосфорные эфиры: флавиномононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). В последние десятилетия открыты новые биокаталитические факторы изоаллоксазиновой структуры, функциональные группы которых представлены модифицированными молекулами РФ, ФМН, ФАД. Новые природные аналоги РФ входят в состав простетических групп многих флавопротеидов.

Дата добавления: 2014-01-04