Тема лекции: генетика микроорганизмов

Физиология бактерий изучает физические, химические и биологические процессы в бактериальной клетке, а также физические, химические и биологические превращения, вызываемые бактериями в окружающей среде.

Бактерии - одноклеточные бесхлорофилльные растительные микроорганизмы.

Бактерии имеют достаточно сложное строение, они содержат основные клеточные органеллы и сложный набор биологически активных макромолекул. Как и все живые организмы, бактерии нуждаются в поступлении из окружающей среды питательных веществ, служащих пластическим материалом для построения тела и источником энергии, обеспечивающим биологические процессы в клетке. В теле бактерий постоянно протекают сложнейшие биохимические процессы с участием биологических катализаторов. Бактерии оказывают существенное влияние на окружающую среду, выделяя в нее ферменты и продукты метаболизма. Так как бактерии широко распространены в природе и принимают участие в круговороте веществ, их роль в поддержании жизни на Земле чрезвычайно велика. Без бактерий жизнь на Земле невозможна.

Патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, основной предмет нашего изучения, также характеризуются сложнейшими биохимическими превращениями внутри клеток, их биохимическая активность обеспечивает им участие в инфекционном процессе.

Все эти сложные метаболические процессы, обеспечивающие жизнедеятельность бактерий, их рост и размножение, требуют специального изучения. Этим и занимается физиология микроорганизмов.

По-видимому, вначале нужно было бы остановиться на морфологии, ультраструктуре и химическом составе бактерий, но ввиду ограниченности объема нашего лекционного курса мы будем опираться на Ваши знания из курса общей биологии, а также на знания, получаемые Вами на наших практических занятиях. Жизнедеятельность бактерий обеспечивается соответствующими клеточными структурами (цитоплазмой, оболочками, ядерным аппаратом, органеллами) и химическим составом. Бактерии состоят воды (75 - 85 % в вегетативных клетках, 40 - 50 % в спорах) и сухого остатка. Вода играет существенную физиологическую роль, являясь основной средой для растворения большинства клеточных компонентов. Нормальный метаболизм, развитие и размножение клеток происходят только в водной фазе окружающей среды. Вода может находиться в бактериальных клетках в виде самостоятельного вещества (свободная вода) либо в соединении с компонентами клетки (связанная вода). Сухой остаток содержит минеральные вещества (2 - 14 %) и органическую часть, состоящую на 50 - 75% из белков, на 10 - 30 % из нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), 12 - 28 % из углеводов, включая полисахариды, на 10 40 % - из липидов. Следовательно, принципиальный состав бактерий мало чем отличается от состава любых живых существ на Земле. Бактерии содержат основные химические элементы - органогены (С, Н, О, Р, S, N) и микроэлементы. В составе бактерий можно обнаружить все известные химические элементы.

2. ПИТАНИЕ БАКТЕРИЙ

Для осуществления процессов роста и размножения бактерий, т.е. жизнедеятельности, необходимы питательные вещества из окружающей среды. Поступление питательных веществ в бактериальную клетку может происходить без энергетических трат, за счет пассивной диффузии (по градиенту концентрации) либо облегченной диффузии (с помощью специальных ферментоподобных белков - пермеаз). Большинство же питательных веществ транспортируются в клетку активным путем, с помощью специфических пермеаз, локализованных в цитоплазматической мембране. Этот процесс происходит против градиента концентрации, причем каждая пермеаза переносит в клетку только определенное вещество, процесс транспорта специфичен. В процессе активного транспорта может происходить химическая модификация веществ, например - фосфорилирование углеводов.

Необходимое условие - усвояемая форма питательных веществ. Соответственно мы выделяем разные типы питания микроорганизмов. Автотрофы (аутотрофы) используют в качестве единственного источника углерода СО₂, для гетеротрофов источником углерода служат разнообразные сложные органические углеродсодержащие соединения. Гетеротрофы в свою очередь делят на метатрофы (требующие относительно простых органических соединений и использующие мертвый питательный материал, их называют «сапрофиты») и паратрофы, или «паразиты» (требующие сложных соединений, часто находящихся только в живых существах). Патогенные микроорганизмы являются метатрофами и паратрофами.

Соответственно типу питания все бактерии разделяют по требовательности к питательным средам на нетребовательные (размножающиеся на общих, универсальных, простых питательных средах) и требовательные (требующие специальных питательных сред).

Конечно, для роста и размножения бактерий недостаточно только питательных веществ в усвояемой форме, нужны также витамины и ростовые вещества, для разных видов различные.

3. ДЫХАНИЕ БАКТЕРИЙ

Для процессов жизнедеятельности бактерий необходима энергия, которую бактерии получают в результате дыхания, или биологического окисления. Все микроорганизмы по типу дыхания делятся на 4 группы.

Облигатные (строгие) аэробы нуждаются в свободном кислороде. Примером может служить Pseudomonas aeruginosa - синегнойная палочка.

Микроаэрофилы и капнофилы нуждаются в небольших количествах кислорода и повышенной концентрации углекислоты. Примером может служить Brucella abortus - возбудитель бруцеллеза крупного рогатого скота и человека.

Факультативные анаэробы, способные менять тип дыхания с аэробного на анаэробный, наиболее часто встречаются среди патогенных микроорганизмов - кокки, энтеробактерии, вибрионы и многие другие.

Облигатные анаэробы получают энергию при отсутствии кислорода, за счет ускоренного, но не полного расщепления питательных веществ. При этом выделяется меньше энергии, поэтому облигатно-анаэробные микроорганизмы должны перерабатывать много субстрата и являются биохимически очень активными. Для строгих анаэробов, таких как возбудители столбняка, ботулизма, присутствие кислорода действует губительно.

При культивировании аэробов обычно не заботятся о создании специальных условий аэрации. Для микроаэрофилов создают сниженное содержание кислорода за счет добавления углекислоты из баллона в замкнутый резервуар для культивирования бактерий. Наиболее простой способ - зажигают ватную пробку, плотно закрывают пробирку и заливают пробку парафином.

Для выращивания строгих анаэробов применяют три способа культивирования: в анаэростате (в специальном приборе, из которого можно откачивать воздух либо заменять воздух инертным газом), на специальной питательной среде Китт-Тароцци (пробирка с глюкозным бульоном и кусочком печени, залитая сверху вазелиновым маслом), в толще глюкозного питательного агара (в высоким пробирках, трубках Бурри, трубках Виньяль-Вейона).

4. ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ

Для осуществления процессов жизнедеятельности необходимо наличие биологических катализаторов - ферментов. Мы не ставим задачу излагать учение о ферментах, это материал курса биохимии. Поэтому здесь лишь скажем, что каждый вид микроорганизмов обладает своим, присущим только этому виду, набором ферментов. Ферментативная деятельность микроорганизмов определяет их роль в круговороте веществ, способность занимать определенную экологическую нишу в микробиогеоценозе. В то же время, определенный набор ферментов часто служит опознавательным признаком для вида микроорганизмов. Поэтому мы изучаем ферменты микроорганизмов и для использования их в промышленности, сельском хозяйств, медицине и для идентификации выделенных культур микроорганизмов, т.е. для определения их видовой принадлежности. В соответствии с этим нам нет необходимости разбирать тонкости механизма действия разных ферментов, как это изучает биохимия. Нам достаточно классифицировать ферменты микроорганизмов по субстратной специфичности, по тому, какие вещества (субстраты) и как изменяются в результате действия ферментов микроорганизмов.

Соответственно мы выделяем: протеолитические, сахаролитические, липолитические ферменты, нуклеазы и оксидо-редуктазы. Не вдаваясь в подробности, которые можно найти в учебниках, скажем лишь, что ферментативная активность микроорганизмов (бактерий) изучается путем посева на дифференциально-диагностические питательные среды.

Одни ферменты бактерий локализуются в цитоплазме, цитоплазматической мембране и органеллах клетки, их называют эндоферментами. Другие ферменты выделяются во внешнюю среду, осуществляют биохимические превращения питательного материала до его поступления внутрь клетки - экзоферменты. Внутриклеточные ферменты могут объединяться функционально и структурно в мультиферментные комплексы. Ряд ферментов бактерий могут быть факторами вирулентности, о чем будет речь на следующей лекции.

5. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ

В естественной природе и в организме хозяина сапрофиты и паразиты самостоятельно находят себе необходимые условия для жизнедеятельности. Однако, нам часто приходится получать популяции микроорганизмов в искусственных условиях. Такие популяции мы называем культурами.

Культура микроорганизмов - это микроорганизмы, размножившиеся на питательной среде в лабораторных условиях. Мы подчеркиваем искусственный, лабораторный характер культур микроорганизмов. Популяция микроорганизмов - это совокупность живых микроорганизмов независимо от того, получена она в лаборатории или развилась в естественных условиях в организме хозяина или вне организма.

Чистая культура -культура одного вида микроорганизмов. Культура может быть смешанной, состоящей из нескольких видов микроорганизмов. Проросшая культура - чистая культура, загрязненная другим видом микроорганизмов. Наша задача - научиться получать чистые культуры бактерий и работать с ними так, чтобы сохранять чистоту выделенной культуры.

Клон - микробная популяция, полученная путем вегетативного размножения одной клетки. По определению клоновая культура должна состоять из бактерий, идентичных по генотипу и фенотипическим признакам.

Штамм - культура микроорганизмов, выделенная из определенного источника. Штаммы бактерий, полученные из разных источников, могут практически не различаться, но некоторые штаммы могут иметь существенные различия. Эти различия недостаточны, чтобы считать штаммы принадлежащими к разным видам или вариантам. Но некоторые штаммы, обладающие полезными свойствами, являются объектом патентования.

Таблица 2.1. Классификация питательных сред

Вид питательной среды	Назначение питательной среды	Примеры питательных сред
Простые (основные)	Для культивирования нетребовательных микроорганизмов	МПБ, МПА
Специальные	Для культивирования требовательных микроорганизмов	Глюкозный МПБ, сывороточный МПБ, кровяной МПА, среда Китт-Тароцци
Дифференциально - диагностические	Для дифференцирования микроорганизмов по биохимическим свойствам	Среды Эндо, Левина, Гисса
Элективные	Для преимущественного накопления определенных микроорганизмов, в то время как рост остальных подавлен	Щелочная пептонная вода, среды Леффлера, Ру, Плоскирева, Мюллера
Консервирую-щие	Для сохранения жизнеспособности микроорганизмов во время транспортировки в лабораторию	Глицериновая смесь

Для роста и размножения бактерий необходимо создать следующие условия, для каждого вида бактерий - определенные:

1. Подходящая питательная среда. Требования к питательной среде: содержание необходимых питательных веществ в усваиваемой форме, определенный рН (чаще всего - слабощелочной, 7,2 - 7,6), нужная консистенция (жидкие, плотные, полужидкие среды), стерильность, по возможности - прозрачность, удобная расфасовка, экономичность. По назначению питательные среды классифицируются на 5 групп (таблица 2.1).

2. Определенные условия аэрации. В зависимости от типа дыхания бактерий им необходимо создать соответствующие условия аэрации.

3. Определенная температура. Нужные температурные условия создаются в термостатах. Подавляющее большинство патогенных бактерий относятся к мезофилам, и оптимальная температура для них равна 37 °С - температура человеческого тела. Однако, есть и исключения. Например, для возбудителей чумы и иерсиноза оптимальная температура равна 25 - 28 °С.

2. Определенные условия аэрации. В зависимости от типа дыхания бактерий им необходимо создать соответствующие условия аэрации.

3. Определенная температура. Нужные температурные условия создаются в термостатах. Подавляющее большинство патогенных бактерий относятся к мезофилам, и оптимальная температура для них равна 37 °С - температура человеческого тела. Однако, есть и исключения. Например, для возбудителей чумы и иерсиноза оптимальная температура равна 25 - 28 °С.

4. Отсутствие вредных воздействий. Рост и размножение бактерий возможны только в том случае, если нет вредных влияний на микроорганизмы. Факторы внешней среды могут губительно действовать на бактерий в такой степени, что бактерии не смогут не только размножаться, но и жить.

Губительно на бактерии действуют температура, некоторые химические вещества и излучение. Это - основные антимикробные воздействия, которые могут приводить к стерилизации (полному уничтожению всех микроорганизмов) либо к дезинфекции (уничтожению прежде всего патогенных микроорганизмов). Стерилизация достигается обработкой высокой температурой, гамма-лучами либо механическим удалением бактерий при фильтровании. Для дезинфекции используют химические дезинфектанты - фенол, лизол, производные хлора, соли тяжелых металлов. Более подробные сведения по этому вопросу студенты должны получить на практических занятиях.

Если бактериям создать указанные условия, они будут расти и размножаться. Рост бактерий - воспроизведение всех клеточных структур, ведущее к увеличению массы клетки. Размножение бактерий - увеличение числа клеток в популяции. Большинство прокариот размножается поперечным делением, некоторые - почкованием, грибы - путем спорообразования. Сразу скажем, что спорообразование бактерий является не способом их размножения, а способом сохранения жизнеспособности клеток в неблагоприятных условиях, так как одна вегетативная форма переходит в одну спору, а спора прорастает в одну бактериальную клетку.

При размножении бактериальной клетки наиболее важные процессы происходят в ее нуклеоиде, состоящем из одной двунитевой молекулы ДНК и содержащем всю генетическую информацию клетки. Репликация (размножение) ДНК начинается в определенной точке и происходит в двух противоположных направлениях сначала на одной нити, а затем - на другой нити ДНК. Синтез дочерних нитей ДНК идет короткими фрагментами по 1 - 2 тыс. нуклеотидов, затем они сшиваются ферментом лигазой. Синтез ДНК бактерий идет по полуконсервативному типу, в результате чего образующиеся две дочерние молекулы ДНК состоят из одной материнской и одной дочерней нитей ДНК каждая.

Параллельно с репликацией ДНК идет образование поперечной межклеточной перегородки. Вначале происходит врастание двух слоев цитоплазматической мембраны, затем между ними синтезируется пептидогликановая клеточная стенка. Параллельно идет увеличение размеров клетки, синтезируются необходимые биополимеры для органелл клетки. Затем дочерние клетки отделяются друг от друга.

Время одного цикла деления, которое называется временем генерации у разных видов бактерий различно - от 11 мин у холерного вибриона, 20 - 30 мин у большинства патогенных бактерий до 14 час у микобактерий туберкулеза. Соответственно видимый рост культуры образуется обычно через 18-20 час, а у микобактерий туберкулеза - спустя 2 - 3 недели. Конечно, время генерации зависит и от состава питательной среды, температуры и условий культивирования.

Если анализировать число живых клеток после посева бактерий на жидкую питательную среду в зависимости от времени, то можно построить кривую роста бактериальной культуры. При этом выделяют фазы роста культуры. Обычно различают 8 фаз, но нагляднее выделять 5 основных:

I - фаза адаптации или исходная стационарная фаза. В это время не происходит размножение бактерий, идет приспособление к питательной среде, иногда даже уменьшается число живых клеток за счет отмирания особей, прошедших пик своей биологической активности.

II - фаза логарифмического роста, когда идет экспоненциальное увеличение числа живых клеток за счет размножения. Логарифм концентрации живых клеток растет пропорционально времени.

III - фаза стационарного максимума. В эту фазу сохраняется примерно постоянное количество живых клеток вследствие того, что число отмерших клеток уравнивается с числом вновь образовавшихся. Культура достигает М-концентрации, максимальной концентрации. М-концентрация - величина постоянная для определенного вида бактерий в определенных условиях.

IV - фаза логарифмического отмирания, когда идет массивная гибель бактерий, логарифм их концентрации уменьшается пропорционально времени.

V - фаза покоя. Постепенно замедляется скорость отмирания бактерий, отдельные клетки сохраняют жизнеспособность какое-то время, но потом наступает полная гибель культуры. Конечно, спорообразующие бактерии могут переходить в состояние споры и сохранять жизнеспособность неопределенно долгое время.

Вызывает интерес причина отмирания бактерий. Ведь если бы одна бактериальная клетка могла беспрепятственно размножаться, то за 5 суток ее потомство выполнило бы бассейны всех морей и океанов на Земле. Обычно называют следующие причины отмирания бактерий: истощение питательной среды, особенно по лимитирующим компонентам, самоотравление популяции токсическими продуктами метаболизма, израсходование растворенного в среде кислорода. Действительно, в производственных условиях для получения более высокого накопления бактериальной массы используют глубинное культивирование в специальных реакторах, где происходит постоянное перемешивание питательной среды и ее аэрация. При культивировании в диализационных мешках, когда создаются условия для постоянной замены питательной среды и удаления шлаков за счет диффузии, также увеличивается масса получаемых бактерий.

Однако, только названными факторами нельзя в полной мере объяснить причины отмирания бактерий. Действительно, в фазе стационарного максимума имеются условия для размножения и одновременно отмирания бактерий, а во время исходной стационарной фазы происходит частичное отмирание бактерий в условиях свежей питательной среды. Попытаемся взглянуть на эту проблему с иной стороны.

Принято считать, что при прямом делении бактерий из одной материнской клетки образуются две равноценные дочерние. В этом случае верной будет теория неумирающей жизни, так как в потомстве можно будет всегда найти какие-то структуры от очень далеких предков, структуры, не синтезированные вновь, а сохранившиеся от материнской клетки. Но это противоречит фундаментальным биологическим законам о смертности всего живого.

Это противоречие снимается, если принять точку зрения некоторых исследователей, которые считают, что при делении бактерий образуются неравноценные клетки. Так, И.Малек (1954) в результате кинематографических исследований обнаружил, что при делении бактерий всегда есть «материнская» клетка, внутри которой дифференцируется новая масса живой материи, отделяющаяся затем в виде «дочерней» клетки. Материнская же клетка может повторять процесс деления несколько раз, после чего закономерно отмирает. Например, при изучении процесса деления E.coli Малек обнаружил, что из одной клетки, полученной в результате деления первичной материнской клетки, рождается 17 новых клеток, а из другой - только 8. Концепция о неравноценности «дочерних» клеток представляется вполне логичной, однако причины неравноценности еще должны быть исследованы.

Необходимо заметить, что существуют какие-то биологические законы, регулирующие численность бактериальных популяций независимо от названных факторов. Если посеять одну бактериальную клетку на питательную среду в чашке Петри, то вырастает ограниченная культура небольших размеров (несколько мм в диаметре), хотя имеется избыток питательной среды и пространства. Боле того, если посеять на жидкую питательную среду число бактерий, превышающих М-концентрацию для этого вида, то вначале вообще не происходит размножения бактерий в условиях свежей питательной среды. Идет отмирание бактерий до М-концентрации, затем поддерживается какое-то время М-концентрация и идет логарифмическое отмирание бактерий. Значит, существуют нам пока неизвестные биологические законы, регулирующие численность микробной популяции. Можно предположить, что это могут быть пока неизвестные химические вещества, выделяющиеся из бактерий и достигающие при определенном числе клеток на единицу объема концентрации, которая ингибирует инициацию деления. Предполагают и возможную роль «митогенетического излучения» клеток. Выяснение этих законов необходимо не только для понимания стратегии живого на Земле, но и для решения многих производственных и народно-хозяйственных проблем.

7. КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ

Каждый вид бактерий отличается особенностями морфологии роста на жидких и плотных питательных средах, приспособленностью к условиям культивирования. Эти особенности мы определяем как культуральные свойства бактерий.

Культуральные свойства бактерий включают требовательность к питательным средам, тип дыхания, температурный оптимум и морфологию роста бактерий на жидкой и плотной питательной среде.

На жидкой питательной среде большинство бактерий дают диффузное помутнение с последующим образованием осадка. Стрептококки дают придонный и пристеночный крошковидный рост, палочка сибирской язвы - осадок в виде комочка ваты. Рост чумного микроба сравнивают со сталактитовой пещерой: образуется пленка, от которой спускаются, как сталактиты, нити. Навстречу растет осадок в виде сталагмитов.

На скошенной плотной питательной среде рост может быть обильными, скудным, сухим, мягким, слизистым. Палочка дифтерии дает рост на свернутой сыворотке в виде шагреневой кожи - несливающийся рост отдельных выпуклых мелких колоний кремового оттенка.

На пластинчатом агаре из отдельных микробных клеток вырастают колонии.

Колония - результат размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде.

Подчеркнем, что колонией мы называем ограниченный рост бактерий только на плотной питательной среде. На жидкой питательной среде вследствие конвекционных токов жидкости, броуновского движения, подвижности бактерий происходит непрерывное перемешивание бактерий, поэтому даже одна микробная клетка другого вида обеспечивает получение смешанной культуры бактерий. Принципиальное отличие плотных питательных сред, введенных в бактериологическую практику Робертом Кохом, в том, что микробные клетки, посеянные в разных участках среды, дают несливающийся изолированный рост культур. Это и обеспечивает получение чистых культур за счет механического разобщения, рассеивания смеси микроорганизмов на поверхности или в глубине плотной питательной среды.

Необходимо добавить, что приведенное нами определение колонии не совсем точно. Колония не обязательно образуется в результате размножения одной микробной клетки, это может быть диплококк, цепочка бактерий или скопление бактерий, посеянное в одно место. Вот почему иногда колонии оказываются смешанными, состоят из двух или нескольких видов бактерий. Однако, с учетом сказанного, данное нами определение колонии вполне приемлемо для выделения главного, того, что колония образуется из одного зародыша и может дать возможность получения чистой культуры бактерий.

В основе принципа выделения чистой культуры лежит получение изолированных колоний микроорганизмов на плотных питательных средах, выбор интересующей нас (подозрительной) колонии по морфологическим признакам и микроскопическому составу с последующим пересевом ее для размножения и сохранения культуры в чистом виде.

Морфология колоний - важный дифференциальный признак бактерий. Бактериолог должен уметь выбрать подозрительную колонию по ее морфологии и микроскопическому составу. При этом обращают внимание на размер, форму, характер краев, поверхности, структуру, цвет, консистенцию колонии. На практических занятиях необходимо будет подробнее остановиться на этом.

8. ПРОДУКТЫ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ БАКТЕРИЙ

При росте и размножении бактерий образуются различные продукты. Все они необходимы бактериям для их жизнедеятельности. Одни из них являются экзоферментами для обеспечивания поступления питательных веществ в предварительно обработанном виде, другие - витаминами и ростовыми факторами для бактерий либо факторами вирулентности бактерий или антибиотиками. Мы используем биосинтетическую активность микроорганизмов в промышленности, сельском хозяйстве, биологии и медицине. Существуют штаммы микроорганизмов, являющиеся продуцентами аминокислот, витаминов, антибиотиков, других лекарственных веществ. В настоящее время биотехнология в значительной мере базируется на специально отобранных либо искусственно полученных штаммах микроорганизмов с полезными свойствами.

Среди продуктов жизнедеятельности бактерий нужно остановится на пигментах. Пигменты - биологические красители. Они различаются по цвету, чаще всего бактериальные пигменты имеют разные оттенки желто-коричневого цвета. Но есть и пигменты красного цвета - у чудесной палочки Serratia marcescens (продигиозин), сине-зеленого цвета - у синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa (пиоцианин), черного цвета - у Aspergillus niger и Bacteroides melaninogenicus, белого цвета - у стафилококка.

Пигменты классифицируют на жирорастворимые (у стафилококка, сарцин, микобактерий), водорастворимые (у синегнойной палочки), практически нерастворимые в воде, органических растворителях и даже в сильных кислотах (у аспергилл и бактероидов).

Пигменты могут выполнять у некоторых бактерий роль дыхательных ферментов, они защищают бактерии от губительного действия ультрафиолетовых лучей.

Некоторые пигменты могут стимулировать защитные силы макроорганизма. Например, из Serratia marcescens получают продигиозан, применяющийся в качестве неспецифического стимулятора иммунной системы для лечения иммунодефицитных состояний.

Пигментообразование является важным дифференциальным признаком бактерий и используется при выборе подозрительной колонии и идентификации выделенной чистой культуры в качестве одного из культуральных признаков бактерий.

9. Роль микроорганизмов в круговороте веществ

Чтобы мы могли оценить роль бактерий в природе следует прежде всего указать, что формирование биосферы Земли произошло около 3-х млрд. лет назад, когда единственными обитателями нашей планеты были прокариотические микроорганизмы - бактерии. Последующее формирование биогеоценоза (совокупности всех живых существ на Земле) шло при обязательном участии бактерий и других микроорганизмов. Нам кажется, что основные обитатели Земли - это животные и растения. Но это не совсем так. Суммарная биомасса бактерий в природных субстратах нашей планеты оценивается в 74,46 ^. 10 ⁹ т. Все растения составляют в сумме 55 ^. 10 ⁹ т, животные - 0,55 ^. 10 ⁹ т, простейшие и водоросли - 1,5 ^. 10 ⁹ т. Таким образом, биомасса бактерий превышает суммарную биомассу всех остальных живых существ на Земле.

Как известно, растения и животные синтезируют большое количество органических соединений, которые в дальнейшем не могут усваиваться этими высокоорганизованными существами. Если бы не было микроорганизмов, способных трансформировать все эти органические соединения в вещества, усваивающиеся растениями и животными, то происходило бы постоянное уменьшение химических элементов в усваиваемой форме. Это привело бы в конце концов к прекращению жизни на Земле.

Именно микроорганизмы, благодаря своей высокой биохимической активности, обеспечивают круговорот веществ в природе.

Например, круговорот азота представляется следующим образом. Все азотосодержащие органические соединения животных и растений попадают в почву в виде их выделений либо тел. Там они под действием совокупности аммонифицирующих бактерий переводятся в соли аммония. Далее соли аммония переводятся в соли азотистой кислоты под действием нитрифицирующих, а соли азотной кислоты - нитратных бактерий. Нитраты (селитры) усваиваются растениями, которые строят свои белки, служащие для питания животных. Так связанный азот органических соединений благодаря бактериям возвращается в круговорот веществ.

Но некоторые бактерии могут производить процесс денитрификации, при котором связанный азот восстанавливается до газообразного. С другой стороны, существуют азотфиксирующие бактерии, способные связывать газообразный азот (клубеньковые бактерии, живущие в корнях бобовых растений). Эти процессы были изучены в первую очередь выдающимся отечественным микробиологом С.Н.Виноградским (1858-1953), создателем почвенной микробиологии.

Известна и роль микроорганизмов в круговороте остальных органогенов - углерода, водорода, фосфора, серы.

Биогеохимические циклы возникли на заре жизни и играют важнейшую роль в формировании и поддержании биогеоценоза.

10. ПРИНЦИПЫ КЛАССИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Центральное понятие в систематике и номенклатуре организмов - вид. В микробиологии понятие вида несколько отличается от известного Вам из курса общей биологии.

Вид - эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющих единый генотип, который в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими и другими признаками.

Генотип вида обеспечивает лишь относительную стабильность признаков, поэтому внутри вида выделяют еще варианты микроорганизмов: морфологические (морфовары), биологические (биовары), биохимические (хемовары или ферментовары), антигенные (серовары) и др. Например, варианты, резистентные к антибиотикам теперь называют резистенсвары.

Виды, связанные генетическим родством, объединяются в роды, роды - в семейства, семейства - в порядки. Далее идут классы, отделы, подцарства и царства.

Согласно 4 - томному изданию определителя микроорганизмов Берги (Bergey’s manual of systematic Bacteriology, 1989) бактерии относятся к царству прокариот - Procaryotae. В нем выделено 16 групп бактерий, внутри групп имеются порядки, классы, семейства, роды и виды. Патогенных или имеющих отношение к микрофлоре человека среди них имеется 13 групп.

Нужно отметить, что классификация микроорганизмов еще не окончательно определилась, поэтому идет постоянное изменение систематики, причем до сих пор идут научные дискуссии об основополагающих принципах систематики микроорганизмов. В медицинской микробиологии мы вынуждены пользоваться прежде всего инструктивными материалами, поэтому не всегда новейшие изменения классификации могут быть использованы в практике. Но с этим приходится мириться.

11. Некультивируемые формы бактерий (НФБ)

У многих видов грамнегативных аспорогенных бактерий существует особенное присбособительное состояние, в которое они, подобно к цистам, могут переходить покоришь за все под воздействием неблагоприятных условий и сохранять свою жизнеспособность в течение относительно длительного времени. Главная особенность этого состояния заключается в том, что такие бактерии не размножаются на питательных средах, в результате чего их нельзя культивировать и выделять в чистой культуре. Такие вегетативные формы бактерий, что не способные к размножению, но сохраняют жизнеспособность, получили название «некультивируемые формы бактерий» (НФБ). Способность к переходу в некультивируемое состояние выявлена и у патогенных для человека и животных бактерий. Например, возбудителя холеры нередко выявляют в такой форме в загрязненных открытых водоемах. У таких форм бактерий, подобно к спорам, значительно сниженная метаболическая активность, они имеют высокую стойкость в внешней среде, могут находиться в нем длительное время. При благоприятных условиях, например, при попадании в организм животных и человека, ФБН могут возвращаться к форме, которая способна размножаться.

Экспериментально доказано, что ФБН могут сохранять свою жизнеспособность в окружающей среде в течение нескольких лет, поддерживая опасность к развитию эпидемии. Поскольку их нельзя выявить традиционными бактериологическими методами, перед санитарной и бактериологической службами возникла новая сложная проблема, связанная с выяснением эпидемиологической и экологической роли форм патогенных некультивируемых бактерий. Единственным надежным способом выявления ФБН в настоящее время является только полимеразная цепная реакция, которая базируется на определении ДНК микроорганизма посредством амплификации генов, высоко чувствительная и не требует культивирования бактерий. Перед микробиологией стоит задача изучения генетических и биологических механизмов, которые предопределяют переход бактерий в такое состояние и реверсию (возврат в выходное вегетативное состояние) из него, а также разработки доступных методов их исследования.

РЕКОМЕНДОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Протченко П.З. Загальна мікробіологія, вірусологія та імунологія. Вибрані лекції: Навч. посібник. – Одеса: Одес. Держ. мед. ун-т, 2002. – 298 с.

2. Пяткін К. Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія. - К: Высшая школа, 1992. - 432 с.

Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. - М: Медицина, 1983. - 312 с.

3. Борисов Л.Б., Козьмин-Соколов Б.Н., Фрейдлин И.С. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / под ред. Борисова Л.Б. – Г.: Медицина, 1993. – 232 с.

4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник под ред. А.А.Воробьева. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. - 691 с.

5. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология /ред. Л.Б. Борисов, А.М. Смирнова. - М: Медицина, 1994. - 528 c.

Лекция 4. ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

4. Содержание лекционного материала: текст лекции

Генетика микроорганизмов - наука о законах наследственности и изменчивости микроорганизмов, т.е. о том, как наследуются признаки у микроорганизмов и как происходит их изменение. Генетика микроорганизмов - популяционная генетика, так как она изучает признаки популяций, а не отдельных особей. Это связано не столько с тем, что современные методы исследования часто оказываются недостаточно чувствительными для изучения свойств отдельных микробных клеток, сколько с тем, что микроорганизмы представляют, как правило, достаточно гетерогенные популяции из-за непрерывно происходящих процесов изменчивости в условиях быстрого размножения гаплоидных организмов.

1. Краткий исторический очерк развития

учения о генетике микроорганизмов

Генетика микроорганизмов прошла в своем развитии 3 этапа. 1-й этап (вторая половина XIX века) характеризовался становлением научной микробиологии, описанием видов микроорганизмов и получением первых данных об изменчивости микробов. В этот период шла борьба между двумя полярными направлениями - мономорфизмом (Кох, Кон), постулировавшим неизменность видов бактерий и плеоморфизмом (Негели), признававшим безграничную изменчивость микробов до такой степени, что говорилось об одном патогенном микроорганизме Coccobacteria septica, способном в зависимости от условий вызывать самые различные инфекционные заболевания. На этом этапе победу одержали мономорфисты.

На 2-м этапе (первая половина ХХ века) происходило постепенное накопление сведений об изменчивости микроорганизмов, влиянии различных воздействий на процессы изменчивости. Важный вклад был сделан работами Г.А.Надсона и Г.С.Филиппова (1925 г.) о мутагенном действии рентгеновских лучей на дрожжи. Однако полагали, что законы наследования и изменчивости высших организмов неприменимы к бактериям.

3-й, современный этап развития генетики микроорганизмов начинается с 1944 г., когда была опубликована работа О. Эйвери, К. Мак-Лауда и М.Мак-Карти, в которой впервые была экспериментально доказана генетическая роль ДНК. Эта работа, основополагающая для формирования молекулярной биологии и молекулярной генетики, была посвящена изучению процесса трансформации у пневмококка, открытого еще в 1928 г. Ф. Гриффитсом. В дальнейшем именно микроорганизмы стали объектом исследования в фундаментальных открытиях современной молекулярной биологии и генетики, а генетика микроорганизмов продолжает занимать авангардное положение в молекулярной биологии и генетике.

2. Классификация форм изменчивости

микроорганизмов

Таблица 2. КЛАСИФИКАЦИЯ ВОРМ ИЗМЕНЧИВОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Основание для классификации	Изменчивость
По характеру меняющихся признаков	свойств: морфологических тинкториальных культуральных биохимических биологических серологических фаголизабельных бактериоциногенных чувствительности к лекарственным препаратам
По диапазону изменчивости	внутривидовая ненаследственная внутривидовая наследственная видообразующая
По механизму изменчивости	мутационная: - спонтанные - индуцированные адаптивная: - модификация - длительная модификация комбинативная: - трансформация - трансдукция - лизогенная конверсия - конъюгация

У микроорганизмов (бактерий) изменчивость морфологических свойств (гетероморфизм) часто бывает при старении культуры и при действии неблагоприятных факторов. Пример изменчивости тинкториальных свойств - окраска грамотрицательных гонококков грамположительно, обычно - при хронической леченной гонорее.

Наиболее яркой формой изменчивости бактерий с изменением многих свойств является S - R- диссоциация. Она возникает в результате изменений в генотипе бактерий (например - интеграции профага) и характеризуется появлением двух типов колоний - гладких S - форм (от англ. smooth - гладкий) и шероховатых R - форм (англ. rough - гладкий). Подробная характеристика диссоциации и свойств бактерий из разных форм колоний приводится в учебниках. Следует лишь добавить, что S - R-диссоциация носит приспособительный характер. Большинство бактерий вирулентно в S- форме, при переходе в R-форму их вирулентность снижается. Однако возбудители чумы, тулляремии, сибирской язвы, туберкулеза, дифтерии, стрептококк и некоторые другие обычно вирулентны в R-форме. Диссоциация бактерий затрудняет диагностику ввиду изменения морфологии колоний и свойств бактерий.

Таблица 1. СВОЙСТВА КЛЕТОК из S- И R-колоний

S -тип	R-тип
Колонии гладкие, правильные, выпуклые	Колонии шероховатые, неровные, уплощенные
Колонии образуют дочерние зародыши	Редко образуют дочерние узелки
У подвижных видов имеются жгутики	У подвижных видов жгутики могут отсутствовать
У капсульных видов хорошо виден слизистый слой	Капсулы отсутствуют
Биохимически более активен	Биохимически менее активен
У большинства патогенных видов вирулентная стадия	Слабо или совсем не вирулентная стадия
Обычно выделяется в остром периоде заболевания	Связан преимущественно с хронческими формами заболевания и носительством
Чувствителен к фагу	Менее чувствителен к фагу
Фагоцитируется слабо	Легко фагоцитриуется

Своеобразной формой изменчивости является переход бактерий в L-форму. L-формы получили такое название потому, что были открыты в институте им. Д.Листера. При переходе бактерий в L-форму они теряют способность образовывать клеточную стенку, превращаются в гигантские шары, которые расшнуровываются на мелкие, авизуальные, фильтрующиеся формы. В дальнейшем такие циклы развития могут повторяться. L-формы растут на питательных средах, образуя мелкие, врастающие в агар колонии с плотным центром и пнистой периферией. L-формы играют важную роль патологии, так как в такой форме бактерии могут длительно сохраняться в организме человека. Описаны L-формы большинства бактерий, патогенных для человека. Возможна реверсия L-форм в исходный вид.

Как это следует из таблицы, наблюдается изменчивость всех признаков, которые мы изучаем при идентификации бактерий. Особое значение для получения вакцин имеет изменчивость биологических свойств бактерий, мы касались этого вопроса на лекции по иммунотерапии и иммунопрофилактике. Изменчивость чувствительности к лекарственным препаратам хотя и несущественна для идентификации бактерий, но играет очень важную роль при антибиотикотерапии и химиотерапии.

Диапазон изменчивости может быть различным, мы обычно наблюдаем внутривидовую ненаследственную и наследственную формы изменчивости, однако эволюционный процесс, продолжается и в настоящее время, хотя он часто и не заметен.

3. Основные понятия генетики микроорганизмов

Прежде чем перейти к характеристике механизмов изменчивости бактерий, целесообразно вспомнить некоторые основные понятия общей генетики, известные из курса биологии. Мы лишь уточним эти понятия применительно к генетике микроорганизмов.

Основное понятие генетики - понятие о гене.

Дата добавления: 2014-01-04