Лабораторно- практическое занятие № 6

Тема: Методы приготовления препаратов микроорганизмов. Цитохимические методы исследования микроорганизмов.

Цель работы: Ознакомить студентов с методами фиксации и окраски.

Техника взятия культуры для приготовления препарата. Пробирку с культурой держат в левой руке почти в горизон­тальном положении вблизи горелки. Перед взятием культуры правой рукой вынимают ватную пробку из пробирки, зажимая ее между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают на пламени горелки. Иглу держат в правой руке большим, указа­тельным и средним пальцами. Обожженной в пламени бакте­риологической иглой из пробирки берут небольшое количество микробной массы.Если культуру берут из жидкой среды, не следует сильно наклонять пробирку, чтобы не смочить ее края и пробку. Для взятия культуры лучше пользоваться петлей. После взятия культуры края пробирки и пробку обжигают в пламени и за­крывают пробирку.

Исследование живых клеток микроорганизмов методами раздавленной и висячей капли. В обоих случаях окрашивание объекта проводят «прижизнен­ными» красителями — витальная окраска. Прижизненными красителями могут служить метиленовый синий, нейтральный красный в концентрациях от 0,001 до 0,0001%.

Оба метода применяют для выявления подвижности клеток микроорганизмов, наблюдения за размножением, образованием и прорастанием спор, установления реакции микроорганизмов на химические соединения и физические факторы воздействия, изучения размеров клеток, характера их располо­жения, определения запасных веществ в клетке.

В случае использования метода раздавленной капли на чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. В нее вносят культуру и смешивают с водой. Накрывают кап­лю покровным стеклом так, чтобы под ним не образовывались пузырьки воздуха. Стеклянной палочкой прижимают покров­ное стекло к предметному и удаляют избыток воды фильтро­вальной бумагой, поднося ее к краям покровного стекла. При просмотре приготовленного препарата под микроскопом с им­мерсионным объективом на покровное стекло наносят каплю кедрового масла.

Для длительных наблюдений за клетками микроорганиз­мов применяют метод висячей капли. Для него требуется спе­циальное предметное стекло с лункой посередине. На стериль­ное покровное стекло наносят иглой негустую суспензию мик­роорганизмов, выращенных в жидкой питательной среде или подготовленных для данной цели. Покровное стекло перевора­чивают и помещают на стерильное предметное стекло с лункой так, чтобы капля свободно свисала в лунку. Для герметичности края лунки смазывают вазелином.

Фиксированные препараты микроорганизмов. Под фиксацией подразумевается та­кая обработка живого объекта, которая дает возможность бы­стро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохра­нив его тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация необходима в случае работы с патогенными микро­организмами (в целях безопасности).

Приготовление мазка. На чистое обезжиренное предмет­ное стекло наносят каплю водопроводной воды. Прокаленной бактериологической иглой из пробир­ки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю воды. Каплю тщательно размазывают пет­лей по стеклу на плошади около 4 см². Для этого прокаленной петлей берут немного суспензии и переносят в каплю воды на другое предметное стекло. Сус­пензию нормальной густоты размазывают тонким слоем по стеклу, затем мазок сушат на воздухе при комнатной темпера­туре или при слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется для избежания коагуляции белков, искажаю­щей структуру и форму клеток. Высушенный препарат фикси­руют.

Фиксация мазка. Ее проводят над пламенем горелки при исследовании формы клеток или при помощи химических со­единений для изучения внутренней структуры клеток. В пер­вом случае препарат три-четыре раза медленно проводят нижней стороной над пламенем горелки. Во втором случае используют хромовые соединения, формалин, осмиевую кислоту, ацетон.

Окрашивание препарата. При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания варьи­рует от 1 до 5 мин, в отдельных случаях занимая до 30 мин и более. По окончании окрашивания препарат промывают во­дой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают и микроскопируют.

Существуют простые и дифференцированные методы окраски. При простой окраске используют какой-либо один кра­ситель, например метиленовый синий, фуксин, генциан фи­олетовый в щелочных или карболовых растворах. При этом прокрашивается вся клетка. При дифференцированной окраске отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями. Таковы методы окраски по Граму, окраски спор. Для окрашивания микроорганизмов применяют кислые и основные красители. Первые вступают в реакцию с веществами основной природы, вторые — кислотной природы. По­скольку в белках есть и основные (NH ^-₂) и кислотные (СООН^-) радикалы, клеточные структуры хорошо окрашиваются и теми и другими красителями.

Из основных красителей наиболее часто в микробиологии применяют: красные — нейтральный красный, сафранин, фук­син, гематоксилин; синие — виктория, метиленовый синий; фиолетовые — генциан фиолетовый, кристаллический фиолето­вый, метиленовый фиолетовый; зеленые — янус зеленый, мети­леновый зеленый, малахитовый зеленый; коричневые — везувин, хризоидин; черные — индулин. Кислые красители могут быть следующие: красные и розовые — кислый фуксин, эритрозин; черные — нигрозин; желтые — конго, пикриновая кислота, флуоресцин. Основные красители интенсивнее окрашивают объект в более щелочной среде, кислые — в более кислой. Чтобы paзличить растворы кислых или основных красителей, в них по­гружают полоски фильтровальной бумаги. Они несут отрица­тельный электрический заряд. В случае основного окрашиваю­щего раствора его катионы, обуславливающие окрашивающую способность, фиксируются отрицательным зарядом бумаги и по ней, вследствие капиллярности, будет распространяться только вода (в виде бесцветной полосы). Если раствор содер­жит кислый краситель, его анионы будут подниматься по бу­маге и окрасят ее.

Красители можно разделить на позитивные и негативные. Позитивные красители окрашивают непосредственно клетки микроорганизмов и другие объекты. Из красителей, применяемых в микробиологии, большинство относится к по­зитивным. Они окрашивают клетки при комнатной температу­ре в течение 30—60с. Негативные красители окрашивают пространство, окру­жающее клетки микроорганизмов. В результате клетки выгля­дят силуэтами на окрашенном фоне.

Окраска клеток микроорганизмов по Грамму. Этот метод дифференциации микробных клеток основан на различии в химическом составе клеточных оболочек. Сущность его в том, что в клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение иода с основным красителем, а у других видов это соединение появляется временно и после обработки спир­том растворяется. Микроорганизмов первой группы называют грамположителъными, второй — грамотрицательными.

Техника окраски па Граму. На хорошо обезжиренное предметное стекло наносят тонкий мазок культуры микроорганизма. Мазок высушива­ют на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашива­ют в течение 1 мин феноловым раствором генциана фиолето­вого (или кристаллического фиолетового), держа стекло в слегка наклонном положении. Затем краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на него на 1 мин раствор Люголя (до полного почернения мазка). Стекло и в этом случае лучше держать в наклонном положении. Препа­рат, не промывая водой, обрабатывают, непрерывно покачи­вая, 96%-ным спиртом в течение 15—20 с. Очень важно четко придерживаться времени обесцвечивания, так как при превы­шении указанного срока обесцвечиваются и грамположительные клетки. Промыв водой, препарат окрашивают фуксином Пфейфера в течение 1 мин. После этой обработки грамположительные микроорганизмы приобретают темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные окрашиваются лишь в цвет дополнитель­ной окраски (фуксина). Результаты окраски по Граму зависят от возраста культу­ры: в старых культурах мертвые клетки всегда окрашиваются грамотрицательно. Поэтому лучше использовать молодые односуточные культуры. Некоторые бактерии (протей) окраши­ваются грамвариабелъно, т.е. часть клеток — как грамположительные, а часть — как грамотрицательные.

Красители и реактивы для окраски по Граму. 1. Феноловый рас­твор генциана фиолетового: генциан фиолетовый — 1 г, спирт 96%-ный — 10 мл, фенол кристаллический — 2 г, вода дистил­лированная — 100 мл.

В некоторых случаях применяют спиртовой раствор генциана фиолетового: генциан фиолетовый (или кристаллический фи­олетовый) — 1 г, спирт 96%-ный (ректификат) — 100 мл, гли­церин — 5 мл. Бутыль со смесью ставят в термостат на 24 ч (можно и дольше), затем фильтруют.

2. Раствор Люголя (иодит калия — 2 г, иод кристаллический — 1 г, вода дистиллироианная — 300 мл). Вначале готовят кон­центрированный раствор нодита калия к 5 мл воды, в нем растворяют иод, потом добавляют воду до 300 мл.

3. Спирт 96%-ный.

4. Фуксин Пфейфера (водный раствор карболового фуксина Циля): 1 мл карболового фуксина Циля (см. 3.2.2) и 9 мл дистил­лированной воды.

Контрольные вопросы:

1. Какие вы знаете методы приготовления препаратов?

2. Что такое фиксация препаратов?

3. С какой целью проводят окрашивание микроорганизмов?

4. Какие вы знаете красители, применяемые в микробиологии?

5. Окраска бактерий по Граму.

6. В чем различия грамположительных от грамотрицательных бактерий?

Дата добавления: 2014-01-04