Лабораторно- практическое занятие № 10

Тема: Микрофлора почвы. Учет численности микроорганизмов (КОЕ) в почве методом последовательных разведений

Цель работы: Ознакомить студентов с методом последовательных разведений.

Почва — наиболее благоприятная среда для развития микроорганизмов. В связи с большой гетерогенностью ее состава для учета численности в ней микроорганизмов с исследуемого участка берут среднюю почвенную пробу.

Сначала готовят суспензии (методом разведения), содер­жащие разные концентрации почвы в 1 мл воды. Для этого на стерильное предметное стекло стерильным фарфоровым шпателем или алюминиевой чайной ложкой берут навеску почвы в 1 г. Предметное стекло, шпатель, ложку фламбируют в пламени горелки или, смочив в спирте, обжигают. Навеску почвы, переносят в колбу на 250 мл с 99 мл стерильной воды. Смесь взбалтыва­ют 5 мин, не смачивая пробку. Стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии, содержащей 10^{-2 г почвы, и переносят в про­бирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Пипетку неод­нократно промывают водой в пробирке, чтобы максимально смыть клетки с ее стенок. Другой стерильной пипеткой берут из колбы еще 1 мл суспензии и помещают во вторую колбу, также содержащую 99 мл стерильной водопроводной воды. Пробирку и вторую колбу взбалтывают 1 мин. Концентрация почвы в пробирке будет 10-3 г, во второй колбе — 10-4 г. Точ­но так же новыми стерильными пипетками переносят по 1 мл суспензии из второй колбы во вторую пробирку с 9 мл и в третью колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды и готовят новые суспензии, содержащие в 1 мл соответственно 10-5} и 10^{-6 г почвы.}

Для определения количества живых клеток, содержащихся в 1 мл суспензии каждого разведения, берут по 1 мл этих суспензий и переносят в стерильные чашки Петри, используя всякий раз новую стерилъную пипетку. На крышках чашек стеклографом отмечают исследуемый вариант и paзведение. Затем в чашки Петри вливают расплавлен­ный МПА, заранее приготовленный и разлитый в пробирки на 20 мл (²/₃ объема) из расчета одна пробирка на чашку. Темпе­ратура агара должна быть примерно 45 °С. Ее определяют, прикладывая пробирку с расплавленным агаром к щеке: если щеке не горячо — среду можно вылить в чашку Петри. Осто­рожными круговыми движениями чашки, не смачивая крыш­ку, агар перемешивают с суспензией. Чашки с застывшим ага­ром переворачивают вверх дном, чтобы избежать попадания на его поверхность конденсационной влаги с крышки, и помещают в термостат при 28—30 °С.

Количество КОЕ в 1 г сырой почвы устанавливают, ум­ножая число колоний в чашке на степень разведения — число, показывающее, во сколько раз в каждом конкретном случае разбавили 1 г почвы. При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете и, чтобы дважды не учитывать одни и те же колонии, подсчитанные отмечают чернилами или тушью. Чтобы не пропустить мелкоточечные колонии, чашки дополнительно просматривают под лупой.

Пример расчета. В 1 г сырой почвы содержится 5600 клеток. При влажности почвы 30% это число клеток будет соответствовать 0,7 г абсолютно сухой почвы. Определяем численность клеток в 1 г абсолютно сухой почвы:

0,7 г абсолютно сухой почвы содержат 5600 клеток

1,0 г»» х

х = 5600 = 8000 (клеток).

0,7

Таким образом, в 1 г абсолютно сухой почвы содержится 8 тыс. живых клеток.

Контрольнве вопросы:

1. Каким образом готовят почвенную суспензию?

2. Посев почвенной суспензии на питательные среды.

3. Подсчет колоний микроорганизмов в суспензии.

Дата добавления: 2014-01-04