Правила работы с культурами микроорганизмов

2.1 Правила работы при пересевах микроорганизмов.

В лабораторных условиях микроорганизмы обычно выращивают в пробирках, колбах, чашках Петри, в жидких питательных средах. Хранят чистые культуры преимущественно в пробирках.

Пробирки с культурами закрыты ватными пробками, которые предохраняют от попадания посторонних микроорганизмов из окружающего воздуха. Эти культуры называют чистыми. Для того, чтобы посторонние микроорганизмы не попадали в пробирку с чистой культурой при приготовлении препаратов и при пересевах, необходимо строго соблюдать правила и порядок работы. Все работы с культурами микроорганизмов и при выделении их из любого материала проводят в зоне пламени горелки.

Из пробирки с твердой питательной средой микроорганизмы берутся бактериологической петлей, сделанной из металлической проволоки и укрепленной в держателе. Петля должна быть предварительно обожжена в пламени горелки для того, чтобы не занести с ней в пробирку посторонние микроорганизмы.

Порядок работы должен быть таким:

1) Зажечь спиртовку или газовую горелку.

2) Взять пробирку с культурой и поместить ее так, чтобы она находилась между большим и указательным пальцем левой руки, поддерживалась средним пальцем и находилась в наклонном положении.

3) Взяв правой рукой держатель петли, прокалить петлю в пламени спиртовки. Обжечь следует и часть держателя.

4) Правой рукой, плотно зажав ватную пробку между мизинцем и ладонью, вращательным движением повернуть пробку, вынуть ее из пробирки и держать в таком положении, следя за тем, чтобы она не касалась окружающих предметов.

5) Обжечь края пробирки.

6) Внести остывшую петлю в пробирку и взять немного микробной массы с плотного бактериального газона. Если культура выращивается в жидкой питательной среде, то культуру также берут бактериальной петлей.

7) Снова обжечь в пламени горелки края пробирки и часть ватной пробки и закрыть пробирку пробкой. Если пробка загорится, немедленно ее внести внутрь пробирки и потушить, закрыв рукой.

8) Взятый петлей материал использовать для приготовления препарата, для посева и т.д.

9) Снова обжечь петлю в пламени, чтобы уничтожить оставшиеся на ней микроорганизмы.

Иногда материал и культуры в жидкой среде берутся пипеткой. В этих случаях пользуются стерильными пипетками, заранее приготовленными в бумажных пакетах или металлических футлярах. Вата, вложенная в открытый конец пипетки, предохраняет от попадания в нее посторонних микроорганизмов. Пробирку с жидкой культурой не следует сильно наклонять, чтобы не смочить ее края и пробку. Пробирку с культурой берут в левую руку, а пипетку захватывают большим и средним пальцем правой руки, зажав ее верхнее отверстие указательным пальцем. Вынимают пробку из пробирки, как указывалось выше, обжигают края пробирки, опускают пипетку в пробирку и снимают указательный палец. Если жидкости, вошедшей при этом в пипетку, недостаточно, то можно затянуть ее осторожно ртом. Затем закрывают указательным пальцем верхнее отверстие пипетки, вынимают ее из пробирки, закрывают пробирку, обжигая, как обычно, ее края и пробку, и только тогда используют взятый материал по назначению. После употребления пипетку необходимо погрузить в стакан с дезинфицирующим раствором.

Не рекомендуется производить резких движений, ходить и т.д. около работающего с чистой культурой, т.к. движение воздуха увеличивает вероятность случайного загрязнения культуры.

2.2 Приготовление препаратов микроорганизмов.

Для просмотра микроорганизмов в оптических микроскопах готовят препараты живых и фиксированных (убитых) клеток.

Препараты готовят на предметных стеклах, толщиной не более 1,2-1,4 мм. Применение более толстых стекол резко снижает четкость изображения, особенно при работе с иммерсионными объективами.

Поверхность стекла должна быть тщательно обезжирена, чтобы капля жидкости (взвесь микроорганизмов) равномерно расплывалась по стеклу.

Лучший способ обезжиривания – обработка хромовой смесью. В повседневной работе можно стекло (сухое) тщательно натереть мылом и вытереть хлопчатобумажной салфеткой.

Покровные стекла должны быть тщательно вымыты и высушены, их толщина не должна превышать 0,15-0,17 мм.

2.2.1 Прижизненные препараты.

Прижизненные наблюдения осуществляются в основном в «раздавленной» или «висячей» капле.

Приготовление препарата для наблюдения в «раздавленной» капле.

Если микроорганизмы выращены в жидкой питательной среде, то для микроскопирования на предметное стекло помещается капля этой жидкости петлей или пипеткой. Если они выращены на твердой питательной среде, то на предметное стекло помещается капля воды из капельницы и в нее вносят петлей микроорганизмы. Если при этом получается очень густая взвесь, то ее следует разбавить: перенести петлю этой взвеси в другую каплю воды на отдельном стекле.

Капля с микроорганизмами накрывается покровным стеклом, и препарат готов для микроскопирования. Нередко под стеклом остаются пузырьки воздуха. Одиночные небольшие пузырьки не помешают наблюдению, но если их много, то препарат надо переделать.

При опускании покровного стекла на каплю следует прикоснуться его ребром к краю капли и, постепенно наклоняя, опустить стекло. Если имеется избыток жидкости, то его следует удалить фильтровальной бумагой.

Препарат «раздавленная» капля позволяет установить форму клеток микроорганизмов, их размеры, взаимное расположение, способ спорообразования, способность к движению.

Приготовление препарата методом «висячей» капли.

Для приготовления препарата методом «висячей» капли используется предметное стекло со специальным углублением, с лункой.

Порядок работы должен быть следующим:

1) края покровного стекла обмазать аккуратно вазелином, пользуясь стеклянной палочкой;

2) поместить в центр этого стекла небольшую каплю жидкости с микроорганизмами;

3) покровное стекло поместить на предметное таким образом, чтобы капля висела над углублением, не прикасаясь к предметному стеклу.

Вазелин должен предохранять каплю от высыхания.

Препарат «висячая» капля используется для выявления подвижности у микроорганизмов, для наблюдения за размножением, образованием и прорастанием спор, отношением микроорганизмов к различным раздражителям.

Прижизненная окраска.

Микроорганизмы можно наблюдать в неокрашенном виде и с прижизненной окраской.

Для прижизненного (витального) окрашивания используются следующие красители: нейтральный фиолетовый, метиленовый синий, зеленый янус, эозин и эритрозин, нейтральный красный в концентрациях от 0,001 до 0,0001 %. При приготовлении прижизненного препарата микроорганизмы вносятся в каплю краски на предметном стекле, после чего капля накрывается покровным стеклом.

Можно поступить и таким образом: поместить каплю краски у края покровного стекла, заранее приготовленного прижизненного препарата (без окраски) и поднести к противоположному краю покровного стекла полоску фильтровальной бумаги. Краска при этом проникает в препарат и микроорганизмы окрашиваются.

2.2.2 Приготовление препаратов фиксированных клеток.

Фиксированные препараты используются для выявления морфологических особенностей и количественного учета микроорганизмов, для проверки чистоты культуры. Под фиксацией подразумевают такую обработку живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в нем, сохраняя тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация необходима в случае работы с патогенными микроорганизмами для безопасности.

Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает следующие этапы: приготовление мазка, фиксацию, окраску.

Приготовление мазка.

На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. Прокаленной бактериологической иглой из пробирки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю. Каплю тщательно размазывают по стеклу на площади приблизительно 4 см ²

Густую суспензию сначала разводят водой. Стерильной петлей берут немного суспензии и переносят в каплю воды на другое предметное стекло. Суспензию нормальной густоты размазывают тонким слоем по стеклу, затем мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется, так как белки коагулируют, искажая структуру и форму клеток. Высушенный препарат фиксируют.

Фиксация мазка

Фиксацию мазка проводят над пламенем горелки при исследовании формы клеток или при помощи химических соединений для исследования внутренней структуры клеток. В первом случае препарат три-четыре раза проводят нижней стороной через верхнюю часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Во втором, используют хромовые соединения, формалин, осмиевую кислоту, ацетон.

Один из распространенных приемов фиксации – обработка препарата 96%-м спиртом или смесью равных объемов этилового спирта и эфира (жидкость Никифорова). Для этого препараты погружают на некоторое время в фиксирующую жидкость.

Окрашивание препарата.

Существует много различных способов окраски микроорганизмов, простых и специальных, которые применяются в зависимости от задач исследования.

При простой окраске для наблюдений за формой микроорганизмов используются спирто-водные растворы какого-либо одного красителя. Например, метиленовый синий или метиленовый фиолетовый, фуксин в шелочных или карболовых растворах. При этом прокрашивается вся клетка. При дифференциальной окраске отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями. Таковы методы окраски по Граму, окраска спор и др.

Для окрашивания микроорганизмов применяют кислые и основных красителя. Первые вступают в реакцию с веществами основной, вторые – кислой природы.

При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания меняется от 1 до 5 мин., в отдельных случаях до 3 мин и дольше. По окончании окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.

Красители можно разделить на позитивные и негативные. Позитивные красители окрашивают клетки при комнатной температуре в течение 30…60с); негативные – пространство, окружающее микроорганизмы. В результате клетки выглядят силуэтами на фоне красителя.

Дата добавления: 2013-12-13