Принципы идентификации бактерий

Литература

Контрольные вопросы

1) Какие микроскопы используют для изучения микроорганизмов?

2) Опишите все детали механической части микроскопа.

3) Для чего предназначены макро- и микровинты? На какое расстояние можно перемещать тубус микроскопа вверх и вниз?

4) Что расположено под предметным столиком?

5) Что такое конденсор и на какое расстояние можно его перемещать?

6) Какие детали включает осветительная часть микроскопа?

7) Для чего нужна ирисовая диафрагма?

8) Дайте определение апертуры конденсора. От каких параметров она зависит?

9) Нарисуйте схему прохождения лучей света через наблюдаемый объект и попадание их на линзу. Укажите отверстный угол.

10) Расскажите о правилах работы с конденсором при разных увеличениях.

11) Что такое объектив? Какую функцию он выполняет? Из чего он состоит? Какие объективы вы знаете?

12) Типы абберации и способы их устранения

13) По какому принципу делятся объективы на ахроматы, апохроматы и планохроматы?

14) Как определить общее увеличение микроскопа?

15) Что означает разрешающая способность микроскопа?

16) Как можно повысить разрешающую способность микроскопа?

17. Каково фокусное расстояние для объективов 8х, 40х, 90х?

18) Функция окуляра в микроскопе и основные увеличения.

19) Основные правила работы при микроскопировании в светлом поле зрения: установка освещения; просмотр неокрашенных препаратов (положение конденсора, состояние ирисовой диафрагмы): просмотр окрашенных препаратов (положение конденсора, состояние ирисовой диафрагмы): правила работы с макро- и микрометрическими винтами: правила работы с иммерсионными объективами.

20) Способы приготовления прижизненных и постоянных препаратов микроорганизмов.

21) В каких случаях используют прижизненные препараты, а в каких – постоянные?

1 Емцев В.Г., Мишустин Е.Н. Микробиология.-М., Дрофа, 2005.

2 Теппер Е.З., Шильникова В.К. Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. – М.: Колос, 1993. – 176с.

3 Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова И.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии. – М, ДеЛи принт, 2004..

Основным условием правильной идентификации микроорганизмов, вне зависимости от используемого при этом метода, является наличие чистой культуры [49]. В связи с этим отколу колонии и последующей макро- и микроскопической проверке чистоты культуры необходимо уделять особое внимание. Следует избегать «откола» сразу нескольких колоний даже при их кажущейся однотипности. Желательно использовать петлю с маленькой головкой или иглу. Не рекомендуется охлаждать петлю, прикасаясь к питательной среде без признаков роста.

В отдельных случаях даже откол отдельно лежащей колонии не гарантирует получения в последующем чистой культуры. Например, колонии слизеобразующих бактерий могут содержать клетки других микроорганизмов, захваченные вместе со слизью. Культуры актиномицетов и представителей рода Bacillus могут иметь контаминанты в полостях между цепочками клеток. При раннем отборе колоний с селективной среды загрязнение может быть связано с захватом контаминантов, находящихся в подавленном, но жизнеспособном состоянии. Даже на неселективных средах откол не следует проводить слишком рано, в связи с возможным наличием медленно растущих микроорганизмов.

Работа по идентификации бактерий начинается еще до выделения чистой культуры - с изучения культуральных свойств, то есть характера роста микроорганизмов на питательной среде. Культуральные свойства бактерий выращенных на плотной питательной среде включают: форму, размер колоний, наличие пигмента, способность к росту при определенной температуре и концентрации углекислого газа и кислорода, на среде определенного состава и т.д. Кроме культуральных свойств еще до выделения чистой культуры иногда могут быть определены морфологические, тинкториальные свойства (например, путем микроскопии мазка из колонии, окрашенного по Граму), некоторые биохимические свойства (например, наличие ферментов оксидазы, каталазы), антигенные свойства (например, с помощью реакции агглютинации или реакции иммунофлуоресценции) и некоторые другие признаки. В отдельных случаях этого бывает достаточно для выдачи предварительного ответа о виде обнаруженного микроорганизма, но чаще всего изучение указанных признаков позволяет лишь наметить путь дальнейших исследований, которые уже выполняются с чистой культурой.

Решающее значение при идентификации большинства видов микроорганизмов имеет изучение их ферментативной активности. В классическом варианте для этой цели используют набор дифференциально-диагностических сред [41]. Однако в последние годы все чаще для идентификации бактерий используют коммерческие идентификационные системы, применение которых позволяет не только повысить точность за счет увеличения числа тестов, но и сократить время исследования [81].

Выявление ферментативной активности основано на одном из пяти феноменов:

Реакции на основе изменения pH. На этом принципе основаны многие тесты, результат которых учитывается через 18-24 час. Рост микроорганизмов на питательной среде сопровождается ферментацией содержащихся в ней субстратов. Расщепление углеводов сопровождается накоплением кислых продуктов, в то время как утилизация белковых веществ, как правило, приводит к защелачиванию среды.

Реакции за счет конститутивных (предсинтезированных) ферментов. Такого рода реакции лежат в основе рапид-систем. Этот же принцип заложен в системах идентификации медленно растущих микроорганизмов или микроорганизмов, требующих особых условий культивирования (например, анаэробы в таких тест-системах могут быть идентифицированы без создания анаэробных условий инкубации). Как правило, такие тесты основаны не на изменении pH, а на использовании хромогенных или флюорогенных субстратов.

Использование меченых источников углерода. Этот метод с использованием меченых тетразолием или радиоактивным углеродом соединений позволяет получить ответ в короткие сроки (до появления видимого роста).

Выявление летучих и нелетучих кислот. Метод основан на выявлении конечных продуктов метаболизма в жидкой культуре при помощи газо-жидкостной хроматографии. Компьютерный анализ результатов и их сравнение с библиотечными данными позволяют осуществить идентификацию культуры.

Визуальное выявление роста. Этот метод используется в системах идентификации грибов и бактерий. Метод основан на выявлении способности микроорганизма к ассимиляции субстрата. Появление помутнения расценивается как положительный результат.

Идентификация выделенной культуры состоит из следующих этапов:

приготовление суспензии и инокуляции лунок;

инкубация;

учет результатов тестов;

интерпретация результатов.

Для приготовления суспензии, как правило, используется стерильный изотонический раствор, однако в некоторых случаях необходимо использовать специальные буферы или инокуляционные среды, входящие в состав набора. Концентрация микроорганизмов в суспензии определяется по оптическому стандарту мутности. В международной практике используется шкала McFarland, в нашей стране – оптические стандарты мутности, производства Российского Государственного института медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича. Неправильное приготовление суспензии (слишком высокая или наоборот низкая концентрация микроорганизмов, использование старой культуры и т.д.) может явиться причиной неправильного срабатывания системы.

В зависимости от конструктивных особенностей диагностического набора для инокуляции могут быть использованы градуированные пипетки, микродозаторы, пастеровские пипетки. В некоторых тест-системах инокуляция осуществляется методом погружения (“Crystal”) или при помощи специального инокулирующего стержня (“Enterotube II”).

Инкубация тест-систем проводится в обычных термостатах или в специальных термостатируемых устройствах, входящих в комплект некоторых автоматизированных систем идентификации (“Vitek”, bioMerieux, Франция). При идентификации анаэробных микроорганизмов, обычно, требуется создание безкислородной атмосферы, однако некоторые системы, основанные на выявлении предсинтезированных ферментов, инкубируются в аэробных условиях. Температура и время инкубации, указанные в инструкции фирмы-изготовителя должны выдерживаться максимально точно. Несоблюдение этих параметров является одной из наиболее частых причин неправильной идентификации культуры.

Учет результатов осуществляют либо визуально, либо при помощи специальных считывающих устройств – «ридеров». Их использование позволяет избежать субъективизма при оценке реакции и в конечном счете повышает достоверность идентификации. В некоторых случаях (реакция Фогеса-Проскауэра, тесты на нитратредуктазу, фосфатазу, индол и др.) перед учетом результата теста в лунку необходимо добавить специальные проявляющие реактивы. При этом необходимо использовать только реактивы, входящие в состав диагностического набора.

После учета всех тестов производится кодирование результатов. В простейшем случае каждый положительный признак обозначают знаком «+», а отрицательный – знаком «-». Такое кодирование без использования компьютера делает заключительный этап идентификации весьма продолжительным и трудоемким. В современных системах идентификации для определения «профиля» (кода) культуры используемые тесты разбивают на триады (таблица 30). Положительный результат каждого из тестов, входящих в триаду оценивается как 2n, где n = 2, 1 или 0, т.е. положительный результат первого теста в триаде кодируется цифрой «4» (22), второго – цифрой «2» (21) и третьего – цифрой «1» (20). Отрицательный результат теста всегда обозначается «0». При сложении результатов тестов в триаде получаем значение от «0» (все тесты в триаде отрицательны) до «7» (все тесты в триаде положительны). Каждая триада дает одну цифру «профиля». Полученный «профиль» может быть использован либо для последующей компьютерной обработки, либо для ручной идентификации с помощью кодовой книги.

Дата добавления: 2013-12-13