Растирание клеток

Гомогенизация

Лизис клеточных стенок бактерий с сохранением и подавлением жизнеспособности клеток

В большинстве экспериментов для выделения и определения внутриклеточных компонентов применяют различные методы разрушения микроорганизмов. Это могут быть ручные и механические гомогенизаторы, растирание клеток с абразивами, растирание замороженных клеток, перемешивание биомассы со стеклянными бусами. Наиболее полное разрушение клеток достигается в случае применения декомпрессионных методов (Х-пресс,Френч-пресс) или ультразвука. Реже применяют осмотический шок и метод замораживания-оттаивания. Описаны также комбинированные методы разрушения микроорганизмов, сочетающие обработку клеточных стенок ферментами с последующим осмотическим шоком полученных сферопластов (протопластов) или растиранием их в гомогенизаторе.
В зависимости от вида микроорганизма применяют различные способы их отделения от среды.

Выделяют следующие способы протопластирования:

Гомогенизацию можно использовать для микроорганизмов с тонкой клеточной стенкой или не имеющих клеточной стенки. Порции биомассы, суспендированные в буферном растворе (3 - 5 объемов), переносят в ручной гомогенизатор и пропускают через него биомассу 10 - 20 раз. При использовании механических гомогенизаторов с быстро вращающимися ножами («блендеров») время обработки обычно не превышает 1—2 мин с интервалами по 20 с промежуточным охлаждением биомассы на льду.

Метод относится к протопластированию с подавлением жизнедеятельности микроорганизмов. Причем, степень разрушения контролируют в фазово-контрастном микроскопе или по количеству белка, высвобожденного из клеток.

Одним из простых, но достаточно надежных способов разрушения клеток микроорганизмов является растирание их суспензий с абразивами. Для этой цели применяют промытый кварцевый песок, толченое кварцевое стекло, пудру окиси алюминия или другие твердые вещества. При разрушении к клеточной пасте постепенно добавляют двойное количество (по массе) абразива и растирают с силой до появления щелкающих звуков (обычно 10— 15 мин после добавления последней порции абразива). В процессе растирания клеточная паста подвергается нагреву, поэтому дно ступки следует охлаждать (на лотке со льдом).
Особо следует отметить способ растирания клеток микроорганизмов, замороженных в жидком азоте, где в качестве разрушающего абразива выступают кристаллики льда, образовавшиеся при быстром замораживании биомассы (вкапывание суспензии в буфере в толстостенную ступку с налитым жидким азотом). При растираниях применяют обычно фарфоровые ступки и пестики. Время обработки зависит от толщины клеточных стенок разрушаемого микроорганизма. Этими способами можно растирать до 30 г сырых клеток за один прием. После растираний к полученной массе добавляют равный объем буферного раствора и центрифугируют для удаления абразивов, неразрушенных клеток и крупных их обломков. Этот способ также относится к методам протопластирования, использование которых приводит к потере жизнеспособности клетки.

Дата добавления: 2014-01-04