Ферментативный лизис клеток

Френч-прессование

Обработка ультразвуком

Ультразвук разрушает микроорганизмы в результате создания высокой степени вибрации и вследствие этого происходит механический разрыв клеток. Для достижения максимального эффекта необходимо применять высокую мощность излучателя и тщательно настраивать его в резонанс с пробой. Следует контролировать уровень пенообразования и перемешивания при обработке, поскольку интенсивное пенообразование приводит к денатурации белков в образующихся тонких пленках на разделе фаз жидкость/газ. Внутренние структуры клеток при этом также подвержены разрушению, что служит классификационным признаком методов, приводящих к утрате жизнеспособности клетки.

Время облучения варьируют от 2 до 15 мин, однако интервалы непрерывной работы обычно не превышают 30 с. В перерывах между разрушениями пробу и излучатель охлаждают ледяной водой. Степень и полноту разрушения контролируют микроскопированием протопластируемой суспензии. За одну обработку можно разрушить примерно 1 г сухой биомассы.

Описанным методом можно разрушать как многие грамположительные, так и грамотрицательные бактерии, но клетки актиномицетов, дрожжей и других грибов таким методом разрушаются с трудом. Иногда для усиления эффекта ультразвуковой обработки к суспензиям клеток добавляют кварцевый песок, стеклянные бусы малого диаметра или пудру окиси алюминия.

Ячейка Френч-пресса (Френч-пресс) предназначена для разрушения микроорганизмов, основанного на перепаде давления в пробе от высокого (550-1400 атм) к атмосферному. Быстрое изменение давления взрывает клетки изнутри и таким образом разрушает их. Метод наиболее применим к суспензиям объемами от 10 до 30 мл; разрушение меньших объемов сложно технически, а больших ― занимает много времени. Время, требуемое для разрушения одной порции клеток небольшого объема, обычно не превышает 10—15 мин. В перерывах необходимо тщательно промывать ячейку от предыдущей пробы и постоянно контролировать состояние полиэтиленового шарика, регулирующего на ячейке степень перепада давления. Френч-прессование приводит к подавлению жизнеспособности микроорганизмов.

Разрушение (лизис) клеточных стенок с применением детергентов и ферментов проводят обычно с небольшими порциями биомассы, причем эти методы дают более стандартную обработку для каждой клетки в суспензии, так как концентрации детергентов и ферментов практически одинаковы в любой порции пробы. Как правило, время ферментативного лизиса не превышает 15—30 мин.При разрушении целостных клеток с помощью ферментов микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность.

Выделение протопластов технически — хорошо отработанная процедура, достаточно легко выполняемая. Однако получить жизнеспособные протопласты непросто. Это зависит от многих факторов — состава ферментов, их качества, рН среды и выбора осмотического раствора. Большое значение имеет физиологическое состояние клеточного материала, его возраст, условия выращивания. Факторы, которые активируют рост биомассы, будут увеличивать вероятность получения жизнеспособных протопластов. Для получения протопластов из суспензионных и клеточных культур наилучшей является поздняя стадия логарифмической фазы роста. В этот период клеточные стенки легче всего поддаются энзиматическому разрушению, а протопласты — наиболее жизнеспособны.

Дата добавления: 2014-01-04