Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Основные термины

Сорбент – твердое вещество, жидкость или их смесь, способная поглощать или удерживать газы, пары или растворенные вещества и используемая в качестве неподвижной фазы.

Адсорбент – твердый сорбент, концентрирующий на своей поверхности газы. Пары или растворенные вещества. Им заполняется хроматографическая колонка.

Элюент – растворитель или смесь растворителей, предназначенная для прокачки анализируемой смеси через хроматографическую колонку (подвижная фаза).

Элюат – раствор, выходящий из хроматографической колонки.

Хроматограмма – графический результат хроматографического процесса. Хроматограмма состоит из ряда пиков, каждый из которых при полном разделении соответствует одному компоненту анализируемой пробы. Площадь или высота пика должна быть пропорциональна концентрации компонента в элюате.

Хроматографическая система состоит из хроматографической колонки, заполненной адсорбентом, через которую при определенной температуре прокачивается элюент определенного состава.

В совокупности с расходом элюента (мкл/мин, мл/мин) хроматографическая система дает условия хроматографирования.

Время удерживания вещества – это время пребывания исследуемого вещества в хроматографе.

Время удерживания определяют от момента ввода пробы вещества в хроматограф до момента регистрации максимума сигнала детектора. Каждое вещество при одних и тех же условиях анализа имеет свое время удерживания. Это позволяет идентифицировать компоненты разделяемой смеси (при соблюдении постоянства условий эксперимента).

Время удерживания несорбируемого вещества – это время удерживания вещества, которое не адсорбируется (не удерживается) адсорбентом.

Виды хроматографии.

В настоящее время наиболее широкое распространение получили:

– ионометрия – основана на использовании веществ (ионообменников), способных обменивать свои ионы на ионы веществ в растворе.

– газовая хроматография (ГХ) – подвижной фазой является газ (или пар). Неподвижной фазой может быть твердый адсорбент (газо-адсорбционная), жидкость (газо-жидкостная).

– высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – подвижной фазой является жидкость. Неподвижной фазой может быть жидкость (жидко-жидкостная), твердый адсорбент (жидкостно-адсорбционная).

Метод используется для определения нитрозаминов в рыбе, бенз(α)пирена в копченостях, пищевых добавок (красителей, консервантов (сорбиновая, бензойная кислоты), антиокислителей в напитках, загрязнителей окружающей среды (пестицидов, афлатоксинов, микотоксинов, остатков лекарственных препаратов), жирорастворимых витаминов (А, Е, D) в маслах, семенах, витамина С в растительном сырье, для определения состава углеводов и органических кислот в соках, вине, шампанском, определения состава триглицеридов в шоколаде и растительном масле, а также состава и содержания сложных эфиров в алкогольных напитках.

Наиболее ценным использованием метода ВЭЖХ является установление фактов фальсификации пищевых продуктов.

Например, можно установить наличие в макаронных изделиях желтого красителя, создающего впечатление о высокой ценности продукта. Определение антоцианов и гликозидов, отвечающих за цвет вина, позволяет определить натуральность вина. Методом ВЭЖХ идентифицируют мочевину, которую добавляют при фальсификации белковых продуктов с целью увеличения азотистых веществ. Обнаружение аминокислоты оксипролина, присутствующей в белках соединительной ткани, т.е. в дешевом сырье, позволяет выявить факт замены им полноценного белка мяса. По качественному составу антоцианов (специфичен для конкретного вида растений) можно выявить фальсификацию красноокрашенных соков путем добавления других красноокрашенных соков. Метод позволяет выявить фальсификацию дорогих природных подсластителей (стевиозидов) дешевыми синтетическими (аспартам, сахарин), например, в винах. С помощью ВЭЖХ можно определить фальсификацию кофе.

При проведении качественного анализа исследователю необходимо ответить на один из двух вопросов:

1. Какому веществу соответствует каждый пик на хроматограмме анализируемой смеси.

2. Какому пику на хроматограмме соответствует искомое анализируемое вещество.

Для проведения идентификации в хроматографии используют чистые вещества, наличие которых предполагается в анализируемой смеси. Такие чистые вещества называются стандартами. Готовят растворы стандартов.

Затем идентификацию проводят следующим образом:

1. Подбираются условия хроматографирования для разделения анализируемой смеси: тип хроматографической колонки, длины волн, на которых ведется хроматографирование (например, 230, 270, и 290 нм), расход элюента, мкл/мин., тип элюента, объем пробы анализируемого вещества.

2. Определяются времена удерживания всех хроматографических пиков анализируемой смеси.

3. В этих же условиях проводится хроматографирование стандарта и определяются времена удерживания его хроматографического пика.

Если ни у одного хроматографического пика анализируемой смеси нет времени удерживания, близкого к времени удерживания стандарта, тогда искомое вещество в анализируемой смеси отсутствует. Если в анализируемой смеси находят хроматографический пик со временем удерживания, близким к времени удерживания стандарта, то возможны следующие варианты:

1) вещество стандарта и компонент анализируемой смеси – одно и то же соединение – в этом случае идентификация закончена.

2) вещество стандарта и компонент анализируемой смеси – одно и то же соединение, но хроматографический пик компонента анализируемой смеси является не разделенным с хроматографическим пиком другого соединения – в этом случае необходимо изменить условия хроматографирования и разделить плохо разделившиеся пики.

3) вещество стандарта и компонент анализируемой смеси имеют близкие времена удерживания, но являются разными веществами. В этом случае необходимо использовать дополнительный к времени удерживания параметр стандарта и анализируемого вещества.

Газовая хроматография используется для комплексного изучения пищевых продуктов, прежде всего анализа летучих веществ, а также жидких и твердых, которые при температуре 400-500ºС переводятся в парообразное состояние без разложения.

В газовой хроматографии подвижной фазой является инертный газ (азот, гелий, водород), который называют газом-носителем. Проба подается в виде паров. Неподвижной фазой является твердое вещество сорбент или высококипящая жидкость, нанесенная тонким слоем на твердый носитель.

Анализ в газовой хроматографии выполняют на газовом хроматографе.

Газ-носитель из баллона с постоянной скоростью пропускают через хроматографическую систему. Пробу вводят микрошприцем в дозатор, который нагрет до температуры, необходимой для полного испарения хроматографируемого вещества.

Пары анализируемой смеси захватываются потоком газа-носителя и поступают в хроматографическую колонку, температура в которой поддерживается на требуемом для проведения анализа уровне. В колонке анализируемая смесь делится на компоненты, которые поочередно поступают в детектор. Сигнал детектора фиксируется в виде пиков и обрабатывается вычислительным интегратором.

Система ввода пробы состоит из испарителя и мембраны из термостойкой резины, которая прокалывается при вводе пробы. Некоторые хроматографы снабжены также специальными дозаторами для ввода газообразных и твердых веществ. Жидкие пробы вводят в хроматограф микрошприцем. Объем пробы жидкости составляет 0,1-1мкл, газа – 0,5-5мл.

В газовой хроматографии используются следующие методы качественного анализа:

– метод веществ-свидетелей – непосредственно после анализа исследуемого образца в идентичных условиях проводят хроматографирование веществ, присутствие которых вероятно в исследуемой пробе. Совпадение времен удерживания компонента анализируемой пробы и вещества-свидетеля является доказательством их идентичности. Можно ввести вещество-свидетель непосредственно в анализируемый образец. В этом случае критерием идентичности является увеличение соответствующего пика на хроматограмме.

– метод относительных удерживаний – проводят анализ образца согласно методике, предварительно к пробе прибавляют определенное количество вещества сравнения. Относительное удерживание определяют по формуле.

Количественный анализ проводят путем измерения параметров пиков веществ на хроматограмме: площади или высоты.

Площадь пика измеряют путем умножения высоты пика на его ширину, измеренную на середине высоты; с помощью интегратора, присоединенного к самописцу.

Основные методы измерения количественных результатов:

– метод внутреннего стандарта – к анализируемой пробе добавляют точно измеренное количество вещества, называемого «внутренним стандартом». Вещество подбирается таким образом, чтобы его пик отличался от пиков компонентов смеси и чтобы растворялся в анализируемой смеси.

– метод абсолютной градуировки – предварительно определяют зависимость между количеством введенного вещества и площадью или высотой пика на хроматограмме. В хроматограф вводят известно количество градуировочной смеси и определяют площади полученных пиков.

– метод внутренней нормализации – основан на определении соотношений между концентрациями компонентов смеси. Сумму площадей всех пиков хроматограммы принимают за 100%, а площадь каждого пика вычисляют в процентах от общей площади.

Дата добавления: 2014-01-04