Окраска включений клеток микроорганизмов

Окраска генома бактерий

О наличии генома при цитохимических исследованиях судят по качественной реакции на дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), которая входит в его состав.

Метод Романовского—Гимза. Этим методом в клетках прокариот одновременно выявляют геном клетки и волютин. Сначала препарат фиксируют 5 мин метиловым спиртом или фиксатором Карнуа. В последнем случае для удаления следов уксусной кислоты препарат промывают спиртом и тщательно высушивают на воздухе. Окрашивают препарат красителем Романовского—Гимза в течение суток, затем ополаскивают слабощелочной (рН 7,2) водой, высушивают и микроскопируют. Геном окрашивается в красно-фиолетовый цвет, цитоплазма — в слабо-розовый.

Красители. Краситель Карнуа содержит абсолютный спирт, хлороформ, ледяную уксусную кислоту в соотношении 6:3:1. Краситель Романовского—Гимза. Промышленность выпускает препарат, представляющий собой смесь азура (органического красителя, полученного из метиленового синего), эозина и мсти-ленового синего. Непосредственно перед употреблением к К) мл дистиллированной воды, имеющей нейтральную или слабощелочную реакцию (рН 7,2), прибавляют 10 капель красителя.

Реакция Фельгена. Ее применяют для окраски ДНК. При слабом кислотном гидролизе нуклеопротеидов происходит отщепление пуриновых и пиримидиновых оснований, ведущее к высвобождению дезоксирибозы, входящей в ДНК. При гидролизе дезоксирибоза переходит в β-гидроксилевулиновый альдегид, который взаимодействует с сернистой частью бесцветной фуксинсернистой кислоты, выделяя фуксин красного цвета. В результате геном окрашивается.

Препараты бактерий обрабатывают фиксатором Карнуа 5 мин, промывают абсолютным спиртом, гидролизуют 7 мин в растворе 1 н. НС1, подогретом до 60 °С, погружают на 1 — 2 мин в холодный раствор 1 н. НС1 и переносят в фуксинсернистую кислоту (реактив Шиффа) на 3—4 ч. Препараты последовательно промывают в трех кюветах с сернистой водой по 20 мин в каждой, затем ополаскивают дистиллированной водой, высушивают и микроскопируют. Геном окрашивается в фиолетовый цвет.

Включения — это вещества, возникающие в результате метаболизма клетки.

Окраска волютина (метахроматических гранул) методом Омелянского. Волютин — полифосфат, запасное фосфор- и азотсодержащее вещество, производное нуклеиновой кислоты. Характерные свойства волютина — сродство к основным красителям и метахромазия, т. е. способность приобретать иной цвет, чем цвет окрашивающего вещества.

Метод окраски основан на плохой растворимости волютина в растворах кислот. На обезжиренное стекло наносят тонкий мазок бактерий, сушат его на воздухе, фиксируют над пламенем и окрашивают карболовым фуксином Циля. Через 0,5— 1 мин промывают препарат водой, обесцвечивают 20—30 с 1%-ным раствором H₂SO₄, промывают, дополнительно 20— 30 с окрашивают метиленовым синим (1: 40), промывают, промокают, наносят масло и смотрят с иммерсионной системой. Гранулы волютина окрашены в красный цвет, на фоне синей цитоплазмы.

Можно окрашивать фиксированные препараты 10—30 с метиленовым синим Леффлера или 1%-ным раствором толуидинового синего, затем промывать препарат водой, промокать фильтровальной бумагой и смотреть под микроскопом. В первом случае (при окраске метиленовым синим) гранулы имеют цвет от синего до фиолетового, во втором — они красные на фоне голубой цитоплазмы.

Окраска гликогена. Гликоген — углевод, животный крахмал. Встречается у эукариот и прокариот. Впервые был обнаружен французским физиологом К. Бернаром в печени крыс при их обильном питании углеводами. Часто гликоген накапливается в клетках дрожжей, бацилл. Для обогащения дрожжевых клеток гликогеном их выращивают на солодовой среде.

На чистое предметное стекло наносят небольшую каплю суспензии микроорганизмов и к ней добавляют такую же каплю раствора I₂ в KI (7 г I₂ и 20 г KI на 100—300 мл дистиллированной воды). Сверху помещают покровное стекло, избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Препарат просматривают с масляной иммерсией.

На препарате Saccharomyces cerevisiae много почкующихся клеток. В образующихся (растущих) почках гликогена практически нет, поскольку углеводы расходуются в процессе активного метаболизма и гликоген не запасается. В материнских клетках окраска гликогена интенсивна — в зависимости от степени его накопления она варьирует от ярко-желтых оттенков до коричнево-желтых.

Включения гликогена хорошо исследовать в 1—2-суточных культурах Saccharomyces cerevisiae и Bacillus mycoides.

Окраска гранулезы. Гранулеза — углевод, крахмалоподобное вещество. Встречается только у прокариот и только в клетках маслянокислых бактерий Clostridium butyricum перед спорообразованием. Обычно гранулезы накапливается значительное количество.

В небольшую каплю суспензии маслянокислых бактерий добавляют такую же каплю раствора Люголя, накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и просматривают с масляной иммерсией.

В качестве объекта следует использовать накопительную культуру маслянокислых бактерии. Ее получают следующим образом: за 3—4 сут до занятий пробирки на ¹/₃ заполняют мелконарезанным неочищенным картофелем, добавляют мел на кончике ножа и доливают доверху водопроводной водой. Пробирки помешают в водяную баню и нагревают при 70 °С 10 мин, затем охлаждают и ставят в термостат при 30 °С.

Для приготовления препарата маслянокислых бактерий берут пипеткой каплю суспензии из придонного слоя жидкости. Гранулеза окрашивается в сине-фиолетовый цвет и локализуется на одном из концов клеток Clostridium butyricum, приобретающих форму веретена в процессе перестройки вегетативных клеток в клетки, несущие споры. Второй конец клетки (с формирующейся спорой) остается неокрашенным.

Окраска жира. Жир содержится в клетках практически всех видов микроорганизмов, особенно много его накапливается при старении культуры.

На предметное стекло наносят небольшую каплю 40%-ного раствора формалина. Петлей в нее вносят культуру микроорганизма. Формалин убивает клетки и разрыхляет их оболочки. Через 5 мин в эту же каплю добавляют небольшую каплю метиленового синего, а спустя 10 мин — каплю судана III (растворимого в жире красителя, индикатора жироподобных веществ). Образовавшуюся общую каплю накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют препарат с иммерсией.

Цитоплазма клеток окрашивается в синий цвет, включения жира — в розово-оранжевый.

Объекты для исследования — старые культуры дрожжей. Bacillus mycoides, Bacillus megaterium.

Многие гранулы, окрашивающиеся Суданом III или Суданом черным В (0,3%-ным раствором в 70%-ном этиленовом спирте), состоят из поли-β-оксимасляной кислоты. Для выявления поли-β-оксимасляной кислоты готовят препарат клеток 24-часовой культуры. Мазок подсушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают Суданом черным 5— 15 мин (краситель может при этом высохнуть, но это не имеет значения). Затем краситель смывают, препарат подсушивают фильтровальной бумагой и обрабатывают ксилолом, несколько раз погружая в него стекло. Время обесцвечивания не должно превышать I мин. Дополнительное окрашивание препарата проводят 0,5%-ным водным раствором сафранина в течение 5—10с. Включения поли-β-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие гранулы в розовой цитоплазме клеток.

Приготовление Судана III. 0,1 г Судана III растворяют в 200 мл 96%-ного спирта или концентрированной молочной кислоты.

Дата добавления: 2014-01-04