Питание микроорганизмов

Материалы и оборудование.

Красители и реактивы для окраски по Граму, выявления кислотоустойчивости бактерий, спор, капсул, жгутиков, генома, волютина, гликогена, гранулезы, жира; предметные стекла, бактериологические петли, спирт с эфиром (1: 1), микроскопы и все необходимое для микроскопирования.

.

4.1. Значение отдельных элементов питания (на примере Aspergillus niger)

Каждый студент получает индивидуальное задание — подготовить питательную среду для гриба Aspergillus niger соответствующего варианта (всего 11 вариантов).

Если это 1-й вариант (контрольная среда), то в состав среды входят все элементы питания, необходимые для грибов (кроме микроэлементов). Если это 2—8-й варианты, то в каждом из них исключен какой-либо один элемент питания. Если это 9—11-й варианты, то в каждом из них присутствует какой-либо один микроэлемент.

Цель опыта — выяснить, как гриб будет развиваться в отсутствие или при дополнительном внесении какого-либо элемента питания.

Варианты питательных сред:

1. Полная питательная среда без микроэлементов, %: сахароза — 10,0; NH₄NO₃ - 0,3; КН₂РО₄ - 0.2; MgSO₄ – 0,05; FеSO₄ -0,01.

2. Та же среда без углерода, исключена сахароза. Для компенсации осмотической активности среды можно внести соответствующее по осмотическому эквиваленту количество хлорида натрия (NaCI), который не оказывает влияния на развитие гриба.

3. Та же среда без азота: исключен NH₄NO₃.

4. Та же среда без фосфора. КН₂РО₄ заменен другой солью, содержащей эквивалентное количество калия, например KCI. При замене одной соли на другую катион замещается калием, анион — хлором; CI не оказывает влияния на развитие гриба.

5. Та же среда без калия: КН₂РО₄ заменен эквивалентным количеством NaH₂PO₄.

6. Та же среда без серы: MgSO₄ и FeSO₄ заменены эквивалентными количествами MgCI₂ и FеCI₃, закисную соль железа можно заменить окисной.

7. Та же среда без магния: MgSO₄ заменен эквивалентным количеством Na₂SO₄.

8. Та же среда без железа. FеSO₄ заменен эквивалентным количеством Na₂SO₄.

9—11. Та же среда с добавлением микроэлементов: в 9-м варианте в состав среды вводят ZnSO₄, в 10-м — MnSO₄. в 11-м — Н₃ВО₃. Концентрация соли, содержащей микроэлементы, во всех трех случаях — 0,01%.

Получив задание, следует рассчитать эквивалентный процент замещающего вещества (это относится ко всем вариантам, за исключением первых трех). Если в каждом из этих вариантов исключить какую-либо соль, то одновременно удаляются два элемента питания вместо одного. Так, в 4-м варианте (среда без фосфора) при удалении КН₂РО₄, одновременно исключаются фосфор и калий. Поэтому калий необходимо внести в среду в эквивалентном количестве в виде КСl.

Пример расчета. Вариант 4-й (среда без фосфора): КН₂РО₄ (0,2% в среде) заменяют КСl.

Молекулярная масса КН₂РО₄ - 136 (39 +2+31+64), a KCI - 74 (39+35).

Сначала определяют содержание (в %) калия в среде (х);

Затем устанавливают количество KCI (в %) (у), эквивалентное изъятому количеству КН₂РО₄:

Aspergillus niger - аэробный организм, поэтому для создания лучших условий аэрации используют колбы Эрленмейера объемом 75—100 мл с 30 мл среды.

Далее рассчитывают количество каждого вещества в граммах в 30 мл среды, зная их процентное содержание.

Пример расчета. Необходим раствор, концентрация NH₄NO₃, в котором 0,3%:

Таким же образом рассчитывают навески всех остальных компонентов среды.

Так как навески в большинстве своем очень малы, что затрудняет взвешивание, удобнее использовать готовые растворы: 20%-ный раствор сахаpoзы. 1%-ный раствор микроэлементов, 10-ный - для всех остальных солей. Для этого надо определить, сколько миллилитров каждого раствора следует взять, чтобы внести соответствующую навеску.

Пример расчета. Для NH₄NO₃:

Подобным же образом рассчитывают все ингредиенты (в мл) для каждого варианта и вносят их в колбу.

Просуммировав объемы растворов в каждом варианте и вычтя полученные суммы из 30, получают количество дистиллированной воды, которое надо добавить в каждую колбу.

Все необходимые соли и caxapoзу вносят тщательно отмытыми пипетками. Сначала пипетки моют под струей водопроводной воды, затем ополаскивают дистиллированной водой. Объемы, составляющие целое число миллилитров, вносят градуированной пипеткой на 10 мл с делениями 0,1 мл, а десятые и сотые их доли — микропипеткой на 1 мл с делениями 0,01 мл.

Колбы со средой заражают спорами гриба Aspergillus niger, закрывают ватными пробками и прикрепляют этикетки с указанием варианта.

Среды перед внесением спор гриба не стерилизуют, так как высокая концентрация сахара и кислая реакция среды за счет кислых солей калия, магния и железа препятствуют росту бактерий.

Для каждого варианта опыта желательна двукратная повторность. Опытные колбы помещают в термостат при 28— 30 °С.

Опыт анализируют спустя 7 су т. Пленка, выросшая в первом варианте, принимается в качестве образца, с ней сравнивают все остальные. Обычно в этом варианте рост гриба очень хороший. Рост гриба оценивают визуально. Для более точной оценки пленку гриба в каждом варианте можно высушить при 105 °С до постоянной массы и взвесить, принимая вес пленки гриба в первом варианте за 100%.

На средах, где исключен тот или иной элемент питания, особенно при большой потребности в нем, гриб не растет или растет очень слабо. Если микроорганизму для роста требуется небольшое количество какого-либо элемента питания (например, FeSO₄ — 0,01%), то исключение его из среды мало сказывается на росте клеточной массы, так как гриб использует примесь этого элемента, имеющуюся в реактивах. При полном удалении из питательной среды необходимого элемента гриб развиваться не будет.

Дата добавления: 2014-01-04