Брожение целлюлозы

Материалы и оборудование

Льняная солома, пробирки, ножницы, водяная баня, раствор Люголя, 5%-ный раствор FeС1₃, пипетки, пинцеты, скальпели, предметные и покровные стекла, микроскопы.

Вводные пояснения. Целлюлоза разрушается в анаэроб­ных условиях различными спорообразующими бактериями, распространенными в почке, навозе, разлагающихся расти­тельных тканях, рубце жвачных животных.

Упрощенно этот процесс может быть представлен сле­дующим образом:

Первый этап — гидролиз целлюлозы целлюлазой, образование дисахарида целлобиозы, ее гидролиз целлобиазой и образование моносахаридов (глюкозы):

(С₆Н₁₀O₅)_n + Н₂О → n С₁₂H₂₂O₁₁

n С₁₂H₂₂O₁₁ + Н₂О → n С₆H₁₂O₆

Второй этап — сбраживание глюкозы:

С₆H₁₂O₆ → CH₃CH₂CH₂COOH + CH₃COOH + СН₃СН₂ОН +

+ СН₃СНОНСООН + НСООН + СО₂ + H₂

Постановка опыта. Для получения накопительной культу­ры мезофильных целлюлозоразрушающих бактерий в круглую плоскодонную колбу вносят около 1 — 2 г фильтровальной бу­маги или вату, нарезанную узкими полосами, и заливают доверху средой следующего состава (%): KNH₄HPO₄— 0,2; КH₂PO₄,- 0,1; СаСl₂ - 0,03: пептон - 0,1; MgSO₄ – 0,05; СaСО₃ - 0,5.

Среду заражают небольшим количеством почвы, закры­вают колбу корковой пробкой с отверстием для выхода газов и ставят в термостат на 30—35 ºС.

Элективные условия в данном случае определяются при­сутствием целлюлозы — источника углерода, который может потребляться только специфичными целлюлозоразлагающими бактериями, имеющими фермент целлюлазу, а также анаэроб­ными условиями. Пептон, введенный в среду в небольшом ко­личестве, практически не нарушает элективности среды, но сильно стимулирует процесс брожения.

Через 7—10 сут начинается брожение целлюлозы, которое длится 2—3 недели. Фильтровальная бумага по мере сбражива­ния слегка ослизняется, желтеет и постепенно разрушается.

Для получения накопительной культуры термофильных целлюлозоразлагающих бактерий можно пользоваться питательной средой следующего состава (в г/л водопроводной во­ды): NaNH₄HPO₄ - 1,0; КН₂РО₄ - 0,5; К₂НРО₄ - 0,5; MgSO₄ — 0,4; NaCl — 0,1; MnSO₄ и FeSO₄ — следы; пептон — 0,5; СаСО₃ - 0,5.

На дно длинной пробирки помещают полоски фильтро­вальной бумаги слоем 1,5—2 см, заливают пробирку на ²/₃ средой и заражают небольшим количеством конского навоза. Пробирку инкубируют при 60 °С. Через 5—7 сут начинают ин­тенсивно выделяться газы. Бумага приобретает желтую окраску и постепенно прекращается в аморфную массу.

Микроскопирование. При исследовании мезофилов из­влекают пинцетом со дна колбы кусочек разлагающейся бу­маги и размазывают по предметному стеклу без добавления воды. Мазок сушат обычным способом, фиксируют на пламе­ни горелки и окрашивают фуксином.

В пробирках с термофилами (инкубация при 30—35 °С) развиваются длинные тонкие палочки с круглой спорой на конце — Clostridium omelianskii (рис. 19). В накопительной культуре термофильных целлюлозоразлагающих бактерий чаще всего наблюдают длинные крупные палочки с грушевидной спорой на конце — С. dissolvens.

	а) Рисунок 19 - Clostridium omelianskii: а — молодые клетки; б — клетки со спорами

Дата добавления: 2014-01-04