Окисление целлюлозы

Окисление

Материалы и оборудование

Соответствующие среды, фильтровальная бумага, пептон, колбы круг­лые плоскодонные на 100—150 мл, корковые пробки с отверстиями, почва, пинцеты, микроскопы и все необходимое для микроскопирования.

Вводные пояснения. Этот процесс наиболее широко рас­пространен в природе, так как целлюлоза составляет подав­ляющую часть растительных остатков. В хорошо аэрируемой почве ее окисляют аэробные микроорганизмы (бактерии, гри­бы и актиномицеты). Они вырабатывают ферменты целлюлазу и целлобиазу, вызывающие гидролиз целлюлозы до глюкозы (см. 7.1.6), которую затем окисляют до СО₂ и Н₂О; промежу­точными продуктами окисления являются оксикислоты:

n С₆H₁₂O₆ + n O₂ → R – CHOHCOOH + CO₂ + H₂O

R – CHOHCOOH + n O₂ → CO₂ + H₂O

Постановка опыта. Для воспроизведения процесса окис­ления целлюлозы в лабораторных условиях можно использо­вать метод Виноградского на гелевых пластинах. Для приго­товления пластин из кремнекислого геля соляную кислоту плотностью (d) 1,9 в высоком цилиндре разбавляют водой до d = 1,10 (на каждые 500 мл концентрированной соляной кис­лоты следует добавить примерно 500 мл дистиллированной воды). Жидкое стекло (Na₂O · 3SiO₂ или K₂Si0₃) наливают в другой высокий цилиндр и разводят дистиллированной во­дой до d= 1,06—1,08 (на 100 мл жидкого стекла следует при­лить примерно 500 мл воды). Для установления плотности растворов пользуются ареометрами. Цилиндры и ареометры после разбавления жидкого стекла и кислоты тщательно от­мывают.

Полученные после разбавления соляную кислоту и жид­кое стекло смешивают в равных объемах; при этом второе ве­щество осторожно прибавляют к первому при постоянном по­мешивании. Чтобы устранить возможность появления в толще геля чечевицеобразных полостей, полученный раствор нагрева­ют до кипения, хорошо перемешивают и разливают в чашки Петри слоем не менее 0,7 см. Через 8—10 ч образуется гель. Дав ему хорошо застыть и обсохнуть сверху, чашки с застыв­шим гелем помещают в эмалированную кастрюлю или боль­шой стеклянный сосуд и ставят под кран для промывания. На водопроводный кран надевают толстую каучуковую трубку, ко­нец которой опускают на дно кастрюли или сосуда. Струя воды должна быть слабой. Промывают в течение 5—7 дней до исчезновения следов хлора 1%-ным AgNO₃ в присутствии HNO₃. Отмытые от следов хлора чашки с кремневыми пласти­нами окунают в кипящую воду, а при необходимости стерили­зуют в кипятильнике Коха при 100 °С 3 раза по 30 мин через каждые 24 ч.

Промытые и прокипяченные гелевые пластины пропиты­вают 2—3 мл среды следующего состава (г/200 мл дистиллиро­ванной воды): KNO₃ – 2,5; К₂НРО₄ - 1,0; MgSO₄ · 7H₂O -0,5; NaCI - 0,5; FеSO₄ · 7H₂O – 0,01; MnSO₄ · 4H₂O - 0,01.

Поверхность геля покрывают стерильным кружком фильтровальной бумаги, по которому раскладывают (по трафа­рету) 50 комочков почвы (диаметром 1—2 мм) или наносят суспензию почвы соответствующего разведения (см. 8.2.1). Чашки помещают во влажную камеру вверх дном и ставят в термостат при 28—30 °С. На 8—10-е сут вокруг комочков почвы появляются розовые, зеленые, желтые, буровато-желтые колонии бактерий.

Плотность обрастания комочков почвы целлюлозоразрушающими микроорганизмами выражают в процентах. Число комочков почвы, разложенных на чашке, принимают за 100%. Затем подсчитывают процент комочков почвы, вокруг которых развились колонии целлюлозоразрушающих микроорганизмов.

При отсутствии гелевых пластин микроорганизмы, окис­ляющие целлюлозу, можно выявить по методу Омелянского. Для этого в колбу Эрленмейера на 100—150 мл наливают 30 мл питательной среды, содержащей в водопроводной воде 0,1% NH₄CI и 0,05% К₂НРО₄. К раствору добавляют ¹/₃ чайной лож­ки испытуемой почвы, погружают в колбу со средой складча­тый фильтр конусом вверх (высота фильтра не должна превы­шать ³/₄ высоты колбы) и ставят в термостат, при 28—30 ºС. На границе между воздухом и средой на целлюлозе будут разви­ваться аэробные целлюлозоразрушающие бактерии. Бумага по­степенно станет слизкой, местами покроется желтыми пятна­ми колоний миксобактерий.

Микроскопирование. На препаратах, приготовленных из колоний, выросших на поверхности геля, можно обнару­жить представителей разных родов. Наиболее часто встреча­ются следующие роды.

Cytophaga (рис. 20, а) — слегка изогнутые, довольно длинные (3—8 мкм) палочки с заостренными концами. При старении переходят в укороченные палочки с округлыми ко­нцами, возможен переход и в шаровидную форму — миксоспоры или миксоцисты, покрытые слизью (покоящееся состоя­ние). Разные виды этого рода образуют на клетчатке колонии в виде желтых, розовых, пурпурных или красно-коричневых пятен, иногда бесцветные.

Cellvibrio — мелкие, слегка изогнутые в виде полумесяца неспорообразующие палочки с закругленными концами. Дли­на их 1,3—2 мкм, ширина— 0,2—0,5 мкм (рис. 20, б). Коло­нии Cellvibrio очень быстро распространяются по поверхности фильтровальной бумаги, окрашивая ее в желто-оранжевый цвет.

Cellfalcicula — палочковидные клетки, утолщенные в центре, с заостренными концами (рис. 20, в). Образуют на целлюлозе слизистые зеленые колонии. Пигмент легко диф­фундирует в среду и окрашивает гель в з е леный цвет.

Polyangium и Sorangium — миксобактерии. Клетки представителей этих двух родов — цилиндрические палочки с тупыми, закругленными концами, при старении укорачиваются и образуют миксоспоры, которые собраны по 12—40 в спорангиоли — составные части плодовых тел. Плодовые те­ла Polyangium представлены на рис. 20, г. На клетчатке эти микроорганизмы образуют колонии в виде слизистого налета желтого, оранжевого или темно-коричневого цвета.

Trichoderma, Fusarium, Alternaria, Stachybotris, Cladosporium, Dematium — представители дейтеромицетов (грибов); эпифитный гриб Fumago (см. рис. 4, г) и другие грибы также ин­тенсивно разлагают целлюлозу.

Активное участие в разложении клетчатки принимают некоторые актиномицеты — Actinomyces violaceus, A. cellulosae и Micromonospora chalceae.

Миксобактерии рода Sorangium легко обнаружить в под­золистых почвах под луговой растительностью и на окульту­ренных почвах. В этих же почвах при благоприятном режиме можно выявить и бактерии рода Cellvibrio, а на унавоженных — Cytophaga. В степных почвах наряду с грибами встречаются бактерии рода Polyangium.

Дата добавления: 2014-01-04