Материалы и оборудование. Выявление нитрифицирующих бактерий на жидких средах

Выявление нитрифицирующих бактерий на жидких средах

Первую и вторую фазы нитрификации можно наблюдать и в жидких питательных средах. Однако в данном случае процессы менее наглядны.

Состав питательной среды для первой фазы (%): (NH₄)SO₄ - 0,2; К₂НРО₄ - 0,1; MgSO₄ · 7H₂O - 0,05; NaCI -0,2; FeSO₄ · 7H₂O - 0,04; CaCO₃ или MgCO₃ – 0,5.

Состав питательной среды для второй фазы (%): NaNO₂ — 0,1; Na₂CO₃ (безводный)- 0,1; NaCI - 0,05; К₂НРО₄ - 0,05: MgSO₄ • 7Н₂О – 0,05; FeSO₄ • 7Н₂0 – 0,04.

Для получения накопительной культуры среды после хо­рошего взбалтывания разливают по 30 мл в колбы Эрленмейера на 100 мл, вносят в них четверть чайной ложки почвы и ста­вят в термостат при 25—30 °С. Спустя 7 сут (а иногда 14 или 21 сут) в среде для первой фазы нитрификации появляется азотистая, а в среде для второй фазы — азотная кислота. После исчезновения аммиака (для первой фазы) и азотистой кислоты (для второй фазы) опыт заканчивают.

При изучении первой фазы нитрификации ус­танавливают образование азотистой кислоты (реакция капельная с реактивом Грисса или цинк-иод-крахмалом в кислой сре­де). В пробирку наливают 1 мл реактива Грисса и 10 мл иссле­дуемого раствора и кипятят. В присутствии азотистой кислоты появляется красное окрашивание. Реактив очень чувствителен к HNO₂. Ход реакции таков:

H₂N - C₆H₄SO₃H + С₁₀Н₇ — NH₂ + NO^-₂ →

Сульфаниловая кислота α -нафтиламин

→ H₂N - C₆H₆ - N=N - C₆H₄ -SO₃H

Азокраситель красного цвета

Реакцию с цинк-иод-крахмалом проводят следующим образом: в лунку фарфоровой пластинки вносят каплю иссле­дуемого субстрата, 3 капли реактива и каплю 20%-ной серной кислоты. В присутствии азотистой кислоты появляется тем­но-синее окрашивание.

При исследовании второй фазы после исчезновения нитрита вносят в лунку фарфоровой пластинки каплю испытуе­мого раствора, затем добавляют 1 каплю H₂SO₄ и 1 кристалл дифениламина. Если в растворе содержится азотная кислота, то образуется темно-синее окрашивание; то же получается и при наличии азотистой кислоты. Поэтому пробу на нитраты с дифе­ниламином используют при отсутствии нитрита.

Для изучения возбудителей первой и второй фаз нитри­фикации из соответствующих культур с поверхности среды петлей захватывают немного материала и готовят мазок.

Гелевые пластины, пропитанные соответствующей питательной сре­дой, свежая почва, часовые стекла, палочки с оттянутым концом и трафарет, необходимые жидкие среды, колбы Эрленмейера, почва, алюминиевые ложки, реактив Несслера и цинк-иод-крахмал, 20%-ный раствор H₂SO₄ (или реактив Грисса). Микроскопы и все не­обходимое для приготовления препаратов и микроскопирования, фар­форовые пластинки с лунками, дифениламин, растворенный в кон­центрированной серной кислоте.

Приготовление реактивов. Реактив Грисса состоит из двух раство­ров: первый — 0,5 г сульфаниловой кислоты в 150 мл разбавлен­ной уксусной кислоты; второй — 0,1 г α -нафтиламина в 20 мл йоды с добавлением 150 мл разбавленной уксусной кислоты.

Цинк-иод-крахмал: размешивают 4 г крахмала с небольшим ко­личеством холодной воды, затем при постоянном помешивании прибавляют к кипящему раствору хлорид цинка (20 г в 100 мл воды). Смесь кипятят до растворения крахмала, добавляют 2 г сухого иодида цинка и доливают водой до 1 л. Раствор хранят в темном месте.

Дата добавления: 2014-01-04