Свободноживущие азотфиксирующие бактерии

Материалы и оборудование

Фиксированные в формалине корни разных бобовых растений с клу­беньками, ботаническая бритва, препаровальные иглы и все необхо­димое для приготовления препаратов и микроскопирования.

Среди свободноживущих азотфиксирующих бактерий наиболь­ший интерес представляют виды родов Clostridium и Azotobacter.

Вводные пояснения для Clostridium pasteurianum. С. pasteurianum — облигатный анаэроб. Энергию для всех про­цессов жизнедеятельности, в том числе и ассимиляции атмос­ферного азота, бактерии этого вида получают за счет маслянокислого брожения (см. 7.1.4). Сбраживают моно-, дисахара и некоторые полисахариды.

В молодой культуре клетки С. pasteurianum имеют форму палочек с перитрихально расположенными жгутиками. Затем клетка образует спору, которая иногда располагается ближе к краю, но чаще — в середине клетки. Споры овальные, окру­жены капсулой. Клетки имеют клостридиальную форму, на­капливают запасное питательное вещество — гранулезу (поли­сахарид, близкий к крахмалу), которая окрашивается при воз­действии раствора Люголя в сине-фиолетовый цвет. В период образования спор гранулеза постепенно исчезает.

Анаэробные азотфиксаторы широко распространены в природе. Они встречаются почти повсеместно в почвах и за­грязненных водоемах.

Постановка опыта с С. pasteurianum. Для получения нако­пительной культуры используют элективную среду Виноградско­го (г/л дистиллированной воды): глюкоза — 20,0; К₃НРО₄ — 1,0; MgSO₄•7H₂O – 0,5; NaCI - 0,5: СаСО₃ – 20,0. Для уче­та С. pasteurianum в почве используют среду Емцева следую­щего состава (г/л дистиллированной воды): NaH₂PO₄ — 0,5; К₂НРО₄ - 0,5; MgSO₄•7H,O - 0,5; NaCI - 0,5; FeSO₄ -0,01; MnSO₄•4H₂O— 0,01; смесь микроэлементов но Федо­рову (см. 6.2.2) — 1 мл; глюкоза — 20; пептон — 5; дрожже­вой автолизат — 0,2 мл; СаСО, — 10; рН 7,0.

Колбу Эрленмейера на 100—150 мл заполняют на 2/3 жидкой средой, предварительно взболтав её. Для инокуляции в среду вносят 1/3 чайной ложки почвы. Элективность среды обеспечивают отсутствие связанного азота и анаэробные усло­вия. Мел добавляют для нейтрализации масляной кислоты. Опыт удобнее ставить в высоких пробирках. Колбы с посевом помещают в термостат при 35—30 °С.

Через несколько дней отмечают помутнение среды и обильное образование газов. На поверхности среды развиваются аэробные микроорганизмы, поглощающие кислород ат­мосферы. После 4—5 дней инкубации культуру анализируют.

Микроскопирование культуры С. pasteurianum. Содержи­мое колбы хорошо размешивают и в течение 15—20 с дают осесть грубым частицам, после чего из середины субстрата пи­петкой берут немного материала и наносят каплю на предмет­ное стекло. К ней добавляют каплю раствора Люголя, накры­вают покровным стеклом и микроскопируют с иммерсионной системой. В клетках С. Pasteurianum, содержащих гранулёзу, она окрашивается в сине-фиолетовый цвет. Как правило, пре­обладают веретенообразные формы (см. рис. 4, ж).

Из продуктов жизнедеятельности, кроме газов (СО₂, Н₂), можно обнаружить масляную кислоту (см. 7.1.4).

Чистую культуру С. pasteurianum выделяют из колоний, по­лученных при посеве накопительной культуры после обязатель­ной ее пастеризации на агаризованную среду Виноградского или на картофельно-морковный агар Емцева: картофельный отвар — 500 мл; морковный отвар — 500 мл; глюкоза — 20 г; К₂НРО₄ — 1 г; MgSO₄•7H₂O - 0,5 г; NaCI, MnSО₄ • 4Н₂О, FeSО₄•7И₂О - следы; пептон — 5 г; дрожжевой автолизат — 0,02 мл; СаСО₃ — 40 г; агар — 6 г. Отвары готовят следующим образом: по 0,5 кг очищенных картофеля и моркови заливают 2 л дистиллирован­ной воды, кипятят 10 мин, фильтруют, затем добавляют дистил­лированную воду до первоначального объема.

Дата добавления: 2014-01-04