Материалы и оборудование. Жидкая среда Виноградского, колбы Эрленмейера емкостью 100— 150 мл или высокие пробирки, почва, алюминиевые чайные ложки или шпатели

Жидкая среда Виноградского, колбы Эрленмейера емкостью 100— 150 мл или высокие пробирки, почва, алюминиевые чайные ложки или шпатели. Микроскопы и все необходимое для микроскопирования препаратов в раздавленной капле, раствор Люголя, пробирки обычные, 10%-ный раствор хлорного железа.

Вводные пояснения для видов рода Azotobacter. Azotobacter chroococcum фиксирует азот в аэробных условиях. Коло­нии азотобактера — темно-коричневого, почти черного цве­та. В жидких культурах бактерии образуют пленку, а на агаре и на гелевых пластинах — слизистые колонии.

Клетки азотобактера плеоморфные — от палочковидных до кокковидных. Располагаются одиночно, парами, часто окружены слизистой капсулой, которая выявляется после окраски клеток фуксином и смеши­вания с разбавленной тушью (рис. 26). Внутри клеток ясно выра­жена зернистость. A. vinelandii на плотных средах образует сарциноподобные скопления.

	а) б) Рисунок 26 - Azotobacter chroo­coccum: а – на гелевых пластинах; б – окрашены фуксином и тушью

Азотобактер более требовате­лен к условиям окружающей среды, поэтому менее распространен в поч­ве, чем С. pasteurianum. В качестве источника углерода усваивает моно-, дисахара, спирты и соли органических кислот, в том числе и бензойную.

Постановка опыта с A. chroococcum. Для выявления азотобактера в почве и определения относительного его содержания можно использовать метод Виноградского на гелевых пласти­нах (см. 7.2.1). Отмытые от следов хлора гелевые пластины пропитывают 3—5 мл питательной среды следующего состава (г/200 мл дистиллированной воды): маннит или тростниковый сахар - 20,0; К₂НРО₄ - 1,0; MgSO₄ • 7Н₂0 - 0,5; NaCI -0,5; FeSO₄•7H₂O - 0,01; MnSO₄•4H₂O – 0,01; CaCO₃ – 5,0. После упаривания среды до исчезновения избыточной влаги на поверхности геля раскладывают по трафарету 50 комочков почвы (см. 8.2.1). С этой целью берут два часовых стекла, фламбируют их, затем в одно помещают исследуемую почву, а в другое — дистиллированную воду. Смоченной водой палочкой с оттянутым концом, предварительно проводя её каждый раз над огнем, захватывают комочки почвы диаметром примерно 2 мм и помещают их на поверхность гелевой пласти­ны. Элективность среды создают отсутствием связанного азота и аэробными условиями.

Чашки с посевом помещают во влажную камеру, и после 5—6 сут инкубации при наличии клеток азотобактера комочки почвы обрастают его колониями.

Для сравнительной оценки заселенности азотобактером разных почв для каждой из них определяют степень обрастания азотобактером комочков почвы по отношению обросших коло­ниями комочков почвы к общему числу комочков на чашке. Это дает возможность установить, какая почва богаче азото­бактером.

Если колонии со временем приобретают бурую окраску, их относят к A. chroococcum; если они образуют зеленый флу­оресцирующий пигмент, то в зависимости от морфологии их относят либо к A. agile, либо к A. vinelandii (A. agile, как прави­ло, обитает в воде). Бесцветные слизистые колонии образуют виды рода Beijerinckia, их можно обнаружить в кислых тропических почвах (красноземах).

Микроскопирование и получение накопительной и чистой культуры азотобактера. Для знакомства с возбудителями аэробной азотфиксации из колонии готовят фиксированные и окрашенные препараты и просматривают их с иммерсион­ной системой. Клеткиазотобактера шаровидные, среди них часто встречаются диплококки.

Для получения накопительной культуры азотобактера можно использовать жидкую среду Бейеринка (г/л водопровод­ной воды): маннит или глюкоза — 20,0; К₂НРО₄ — 0,2; СаСО₃ — 5,0; смесь микроэлементов по Федорову — 1 мл (см. 6.2.2); MgSO₄ • 7Н,0 - 0,2.

В колбы Эрленмейера на 100 мл наливают по 30 мл жид­кой среды для азотобактера и добавляют 1/3 чайной ложки почвы. Колбы пометают в термостат при 28—30 °С. После 5— 6 дней инкубации опыт снимают; на поверхности среды при наличии азотобактера образуется пленка.

Для выделения чистой культуры азотобактера после про­верки накопительной культуры под микроскопом делают посев на агаризованную среду Эшби следующего состава (г/л водо­проводной воды): маннит — 20,0; К₂НРО₄ — 0,2; MgSO₄•7Н,О – 0,2; NaCl – 0,2; K₂SO₄ – 0,1; СаСО₃ - 5,0; агар -20,0. Добавляют смесь микроэлементов по Федорову — 1 мл (см. 6.2.2).

Дата добавления: 2014-01-04