Приготовление почвенной суспензии и посев

Взятие средней почвенной пробы и подготовка образца

Среднюю почвенную пробу получают смешиванием отдельных образцов, количество которых зависит от микрорельефа (ров­ный, волнистый, склон), степени гетерогенности почвы и ее од­нородности в ботаническом отношении. Рекомендуют с площа­ди 100 м² брать пробу из трех точек; с площади, превышающей 100 м², — из пяти по принципу конверта (четыре в точках по уг­лам и одну — ближе к центру прямоугольника); с 1 га и более — из 15 точек. При исследовании пашни пробы берут с глубины всего пахотного слоя, снимая верхний слой толщиной 2 см; при изучении микрофлоры почвенного профиля — по генетическим горизонтам (снизу вверх).

Почвенный образец берут буром, лопатой и ножом. В поле перед взятием образца их тщательно очищают, затем обрабатывают спиртом и обжигают. Можно ограничиться очи­сткой этих предметов, если затем несколько раз воткнуть их в почву изучаемого горизонта. Укладывают образец в заранее приготовленную стеклянную широкогорлую стерильную бан­ку, закрывающуюся корковой пробкой, обернутой стерильной бумагой, либо в стерильные пергаментные пакеты или пакеты из плотной бумаги, взятой двойным слоем. На пакеты, банки наклеивают этикетки с указанием места взятия пробы, гори­зонта и других сведений.

Почвенные образны анализируют в первые сутки. При необходимости допускается хранение их и холодном помеще­нии (и холодильнике) в течение двух дней. Для придания сред­нему образцу большей однородности, соблюдая все условия асептики, тщательно перемешивают почну, вынимают корни растений, различные включения.

На стерильное часовое стекло стерильным шпателем (или алюминиевой ложкой) помешают 10 г почвы. Чтобы при взвеши­вании в почву не попали микроорганизмы из воздуха, особен­но споры грибов, часовое стекло накрывают другим часовым стеклом. Предварительно стекла взвешивают. Часовые стекла, шпатели и ложки стерилизуют фламбированием.

Навеску почвы переносят в колбу на 250 мл со 100 мл стерильной водопроводной воды, взбалтывают 10 мин (лучше на механической качалке) и дают отстояться грубым частицам почвы.

Одновременно со взятием навески для анализа из сред­ней пробы отбирают 10—20 г почвы для определения влажнос­ти, так как полученные при анализе данные пересчитывают на 1 г абсолютно сухой почвы.

Значительно больше микроорганизмов выявляется, если навеску почвы предварительно поместить в стерильную фар­форовую чашку или ступку, увлажнить (0,4—0,8 мл воды или 0,1 %-ным раствором пирофосфата Na₄Р₂О₇ - на 1 г почвы) и 5 мин растирать стерильным резиновым пестиком или паль­цем в стерильной резиновой перчатке до пастообразного состояния. Этот прием дает возможность разрушить почвенные агрегаты и десорбировать микроорганизмы с поверхности поч­венных частиц и из органоминерального геля.

Перед приготовлением суспензии для каждого образца готовят 2 стерильные колбы на 250 мл; одна содержит 100 мл стерильной водопроводной воды, другая — пустая. Водой из первой колбы растертую почвенную массу смывают в пустую стерильную колбу. Колбу с полученной суспензией встряхива­ют 5 мин, оставляют на 30 с и готовят разведения, содержащие разные концентрации почвы. 1 мл суспензии в первой колбе соответствует разведению 10^-1. Последующие разведения (10^-2; 10^-3; 10^-4; 10^-5; 10^-6 и т.д.) лучше тоже делать в колбах на 250 мл с 90 мл стерильной водопроводной воды.

Из каждого предыдущего разведения отдельной стериль­ной пипеткой берут 10 мл суспензии и переносят в следующую колбу с 90 мл воды. Всякий раз пипетку ополаскивают и от­ставляют. Последующие колбы встряхивают по 1 мин.

Из полученных разведений делают посев на плотные и жидкие среды. Набор сред зависит от задач бактериологиче­ского анализа почвы.

На плотные питательные среды посев проводят преиму­щественно поверхностно. Для этого агаризованные питатель­ные среды разливают в стерильные чашки Петри и после ох­лаждения подсушивают в термостате при 40 °С. На поверх­ность агаровой пластины стерильной градуированной пипеткой наносят 0,05 мл почвенной суспензии из соответствующего разведения, затем стеклянным шпателем Дригальского растирают каплю досуха; при этом открытую чашку держат в вертикальном положении около пламени горелки. Посев из каждого разведения проводят минимум на 2—3 параллельных чашках (желательно — на 5).

При определении количества бактерий в почве пахотного слоя для посева на МПА, крахмалоаммиачном агаре (КАА), среде Чапека используют разведения 10^-3 и 10^-4; на сусло-ага­ре, МПА + сусло-агар, бедных средах (нитритный агар), на среде Эшби применяют разведения 10^-2 и 10^-3. Для почв ниж­них горизонтов соответственно используют разведения на один порядок меньше.

Для глубинного посева берут 1 мл почвенной суспензии из разведения на порядок меньшего, чем для поверхностного посева.

Суспензию вносят в стерильную чашку Петри, заливают агаром, расплавленным и охлажденным до 45 °С, и смешивают с ним. При глубинном посеве показатели получаются более низкие, чем при поверхностном.

При учете микроорганизмов почвы в жидких средах по­следние разливают в пробирки по 9 мл и стерилизуют. Из каж­дого разведения почвенной суспензии, начиная с самого высо­кого, отдельной стерильной пипеткой берут по 1 мл и перено­сят в жидкую среду. Из каждого разведения засевают минимум 2 пробирки или колбы (лучше 3—5).

Когда численность отдельных групп микроорганизмов в почве небольшая, их выявляют методом обрастания комочков почвы по Виноградскому. Отмытые от следов хлора (см. 7.2.1) и прокипяченные или простерилизованные гелевые пластинки пропитывают 3—5 мл элективной среды для соответствующей группы микроорганизмов. Обычно среду упаривают в сушиль­ном шкафу при 40—50 °С до образования эмалевой поверхно­сти (см. 8.2.1). По поверхности раскладывают по трафарету 40—50 комочков почвы диаметром 1—2 мм.

Чашки помещают во влажную камеру и ставят в термос­тат. Если в комочках почвы находятся соответствующие мик­роорганизмы, то они начинают развиваться и формируют во­круг комочков колонии. Затем вычисляют количество оброс­ших комочков почвы (в % от исходного числа). После определенного срока инкубации при 28—30 °С культуры ана­лизируют.

Дата добавления: 2014-01-04