Случайный мутагенез с использованием аналогов нуклеотидов

Ген-мишень встраивают в плазмиду поблизости от двух тесно расположенных сайтов рестрикции. Эти сайты подбирают так, чтобы после расщепления двумя рестриктазами образовывались укороченные 3’ и 5’-концы, а именно, чтобы 3’-конец сайта расщепления, расположенного рядом с клонированным геном, был укорочен, а 3’-конец с другой стороны плазмиды выступал. Экзонуклеаза III E. сoli (отщепляет нуклеотиды с 3’-концов двуцепочечной ДНК) расщепляет молекулу ДНК только с укороченных 3’-концов, но не с выступающих 3’- или любых 5’-концов. Ее добавляют в реакционную смесь после инкубирования ДНК с двумя рестриктазами, и она отщепляет от укороченного3’-конца цепи по одному нуклеотиду. Через определенное время реакцию останавливают и заполняют пробел с помощью ДНК-полимеразы, используя смесь обычных четырех дезоксирибонуклеотидов с добавлением аналога одного из них. В результате получают плазмиды, содержащие ген-мишень, в одном или нескольких сайтов которого находится аналог соответствующего нуклеотида. Ими трансформируют клетки E. сoli. Плазмиды реплицируются, и в клонированный ген включается нуклеотид, отличный от такового в исходном гене.

Дата добавления: 2014-01-05