Уменьшение числа свободных сульфгидрильных групп

Замена аспарагина на другие аминокислоты.

Образование дополнительных дисульфидных связей.

Генная инженерия белков.

Большое количество ферментов не используется потому, что присущая им активность не удовлетворяет требованиям, предъявляемым высокоспециализированными процессами, протекающими in vitro. Большинство ферментов быстро денатурируют при высокой температуре и в присутствии органических растворителей, а именно в этих условиях протекают многие промышленные процессы. Конечно, термостабильные ферменты можно выделить из термофильных микроорганизмов, однако эти организмы не всегда синтезируют именно те специфические ферменты, которые нужны.

Термостабильность белковых молекул можно повысить, внеся в них изменения, благодаря которым они дольше не разворачиваются при повышении температуры. Кроме того, такие термостабильные белки часто не разрушаются и при нефизиологических условиях (при экстремальных рН). К значительному повышению стабильности белковой молекулы может привести образование в не дисульфидных связей. Основная проблема здесь заключается в том, чтобы эти связи не мешали нормальному функционированию белка. Для этого два, четыре или шесть специфических аминокислотных остатков в полинуклеотидной цепи заменяют на остатки цистеина, в результате чего образовывалась одна, две или три дисульфидных связи соответственно.

При высоких температурах остатки аспарагина и глутамина могут дезамидироваться с образованием аммиака. Теряя амидную группу, они превращаются в аспарагиновую и глутаминовую кислоты соответственно, что приводит к локальным изменениям конформации полипептидной цепи и как следствие – к утрате активности белков, в которые они входят.

Чужеродный белок, синтезируемый в организме-хозяине, иногда оказывался менее активным, чем ожидалось, и чтобы повысить его активность, можно использовать методы генной инженерии. Например, при экспрессии в E. сoli клонированной комплементарной ДНК (кДНК) b-интерферона человека (ИФb) белковый продукт обладал в 10 раз меньшей противовирусной активностью, чем нативная гликозилированная форма. При этом ИФb синтезировался в довольно большом количестве, однако почти все его молекулы образовывали димеры и более высокомолекулярные неактивные комплексы. Как показал анализ нуклеотидной последовательности гена ИФb, в нем присутствуют три остатка цистеина, и один из них или несколько, возможно, участвуют в образовании дисульфидных связей, приводящих к образованию димеров и олигомеров в клетках E. сoli, но не в клетках человека. Было высказано предположение, что замена одного или нескольких цистеиновых кодонов на сериновые приведет к синтезу интерферона, не образующего олигомеров. Серин был выбран потому, что его структура сходна со структурой цистеина за исключением того, что вместо серы он содержит кислород и потому не может образовывать дисульфидные связи.

Дата добавления: 2014-01-05