Лимоннокислый цикл и окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты

Детальное рассмотрение центральных путей метаболизма целесообразно начать с разбора предварительной реакции, поставляющей в лимоннокислый цикл ацетилкоэнзим-А – реакции образования ацетил-коэнзима А из пировиноградной кислоты. Эта важная подготовительная реакция лимоннокислого цикла непосредственно не входит в число реакций лимоннокислого цикла, но их совместное рассмотрение облегчает понимание важнейших аэробных превращений веществ в организме. При этом следует помнить, что в пировиноградную кислоту на второй стадии катаболизма (или первой стадии биологического окисления) превращаются многие вещества (моносахара, глицерин, 5 аминокислот) и таким образом, этап превращения пировиноградной кислоты в ацетил-КоА выступает как предварительный общий этап катаболизма для этих веществ.

Реакция образования ацетилкоэнзима-А из пировиноградной кислоты катализируется специальным ферментом – дегидрогеназой пировиноградной кислоты (точнее - пируватдегидрогеназной системой, локализованной внутри митохондрий). Это – мультиэнзимная система с М=4 млн. 500 тыс. у кишечной палочки, а у млекопитающих 6-8 млн дальтон, состоящая из множества белковых субъединиц, образующих три фермента (пируватдекарбоксилазу, липоилредуктазуацетилтрансферазу и дигидролипоилдегидрогеназу), соединенных с различными коферментами – тиаминпирофосфатом, коэнзимом А, липоевой кислотой, ФАД и НАД. При этом коэнзим-А и НАД – внешние коферменты, непрочно связанные с комплексом. Дегидрогеназа пировиноградной кислоты осуществляет как декарбоксилирование (с помощью пируватдекарбоксилазы), так и дегидрирование (с помощью липоилредуктазыацетилтрансферазы) пировиноградной кислоты. Этот процесс получил название окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты. Весь процесс можно изобразить в виде схемы:

пируватдекарбоксилаза

пируват + ТПФ оксиэтил – ТПФ + ЛК

CO₂

липоилредуктаза-

ацетилтрансфераза +ЛК

ацетилгидролипоевая к-та + КоА

ТПФ ацетил-КоА

дигидролипоилдегидрогеназа

дигидролипоевая к-та + ФАД ФАД·Н₂ + НАД
ЛК

ФАД + НАД·Н₂

Механизм окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты сложен и состоит из нескольких фаз (пяти фаз или этапов). Первая фаза указанного комплексного процесса состоит в декарбоксилировании пировиноградной кислоты при участии тиаминпирофосфата в качестве кофермента пируватдекарбоксилазы.

Образовавшийся оксиэтилтиаминпирофосфат далее распадается с отщеплением и одновременным окислением оксиэтильного радикала при участии фермента липоилредуктазыацетилтрансферазы, несущего в качестве простетической группы остаток липоевой кислоты.

Возникший при распаде оксиэтилтиаминпирофосфата ацетильный радикал присоединяется сначала к липоевой кислоте с образованием ацетилгидролипоевой кислоты (вторая фаза), а затем передается на коэнзим-А с образованием ацетилкоэнзима-А и дигидролипоевой кислоты (третья фаза). Далее при посредстве третьего компонента мультиэнзимного комплекса дигидролипоилдегидрогоназы, содержащего в качестве простетической группы ФАД, дигидролипоевая кислота переходит в липоевую кислоту, а ФАД восстанавливается (четвертая фаза).

Восстановленный ФАД дигидролипоилдегидрогеназы обладает исключительной способностью передавать атомы водорода окисленной форме НАД (пятая фаза).

Таким образом, в итоге окисления пировиноградной кислоты в ацетилкоэнзим-А осуществляется одно декарбоксилирование и одно дегидрирование субстратов с приростом свободной энергии (~8,0 ккал, ~33,5 кДж). Поскольку окисление пировиноградной кислоты в ацетилкоэнзим-А – сильно экзергоническая реакция, в клетке она практически необратима.

Установлено,что пируватдегидрогеназная система регулируется уровнем АТФ. Когда содержание АТФ в клетке начинает превышать определенный уровень, пируватдегидрогеназная система, поставляющая «топливо» для лимоннокислого цикла, выключается путем фосфорилирования с помощью протеинкиназы. Активация пируватдегидрогеназы стимулируется АДФ и регулируется инсулином.

Восстановленный пиридинпротеид (НАД.Н₂) подвергается последующему окислению в дыхательной цепи с образованием 3АТФ путем окислительного фосфорилирования.

Ацетилкоэнзим-А, несущий макроэргическую связь, энергично обменивается далее в лимоннокислом цикле.

Лимоннокислый цикл (его также называют циклом трикарбоновых кислот, циклом ди- и трикарбоновых кислот, циклом Сент-Дьерди-Кребса, циклом Кребса, метаболическим котлом Кребса) занимает особое место в обмене веществ, так как является общим конечным путем окислительного катаболизма всех видов веществ в аэробных условиях.

Главная функция цикла заключается в дегидрировании уксусной кислоты (поступающей в цикл в виде ацетилкоэнзима А), которое в конечном итоге приводит к образованию четырех пар атомов водорода и образованию двух молекул СО₂, что можно выразить следующей суммарной реакцией:

СН₃СООН + 2Н₂О à 2СО₂ + 8Н

Этот процесс включает ряд последовательных ферментативных реакций, замкнутых в цикл (8 реакций).

Лимоннокислый цикл протекает в митохондриях клеток. Вступая в лимоннокислый цикл, образовавшийся в результате окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты или иным путем (β-окисление жирных кислот) ацетилкоэнзим-А конденсируется со щавелево-уксусной кислотой, которая всегда есть в клеточном содержимом. Образуется лимонная кислота и высвобождается коэнзим-А. Это есть начальная реакция лимоннокислого цикла, протекающая при участии так называемого конденсирующего фермента (цитратсинтазы). Цитратсинтаза содержится в значительном количестве в тканях, обладающих высокой интенсивностью окислительных превращений. Цитратсинтаза относится к регуляторным ферментам; она ингибируется АТФ (конечным продуктом, в форме которого запасается энергия, высвобождающаяся в процессе дыхания) и НАД.Н₂. (конечным продуктом реакций лимоннокислого цикла, связанных с дегидрированием).

Вследствие большого изменения свободной энергии (~7720 кал; 32,3 кДж) реакция конденсации является практически необратимой.

Освободившаяся энергия выделяется в виде тепла, образования АТФ не происходит. Под действием фермента аконитазы в реакции изомеризации лимонная кислота превращается в изолимонную, причем в качестве промежуточного продукта образуется цисаконитовая кислота. Аконитаза по своему механизму действия является одновременно и гидратазой и изомеразой

В следующей реакции под действием фермента изоцитратдегидрогеназы изолимонная кислота дегидрируется в щавелево-янтарную кислоту. Имеются НАДФ ‑ и НАД‑зависимые изоцитратдегидрогеназы. НАД.Н₂ подвергаются последующему окислению в дыхательной цепи с приростом свободной энергии и аккумулированием ее в АТФ. Этот ферментный белок катализирует также реакцию декарбоксилирования щавелево-янтарной кислоты в α‑кетоглутаровую кислоту, т.е., этот фермент обладает двойным действием. Поэтому его также называют изоцитратдегидрогеназа декарбоксилирующая. Для обеих реакций необходимы ионы Mg⁺⁺ или Мn⁺⁺. Изоцитратдегидрогеназа – аллостерический фермент, обычно лимитирующий скорость всего лимоннокислого цикла в целом. Фермент активируется АДФ и ингибируется АТФ, а также НАД.Н₂, при накоплении их в клетке выше определенного уровня.

Следующая реакция – превращение α‑кетоглутаровой кислоты в янтарную – происходит с помощью фермента α‑кетоглутаратдегидрогеназы, точнее комплекса ферментов – α-кетоглутаратдегидрогеназной системы. Это реакция окислительного декарбоксилирования. Она протекает принципиально по тому же механизму, что и окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты. При участии коэнзимов окислительного декарбоксилирования (тиаминпирофосфата, НS‑КоА, липоевой кислоты, НАД, ФАД) возникает активный сукцинат, т.е. сукцинил-КоА. Для реакции необходимы ионы Мg⁺⁺.

НАД.Н.₂ подвергается последующему окислению в дыхательной цепи с выделением энергии, аккумулируемой в процессе окислительного фосфорилирования в 3 молекулах АТФ.

Сукцинил-КоА затем расщепляется на янтарную кислоту и коэнзим А. Реакция катализируется ферментом сукцинаттиокиназой.

Энергия расщепления сукцинилкоэнзима-А накапливается в гуанозинтрифосфате (ГТФ).

Вслед за этим в сопряженной реакции перефосфорилирования АДФ фосфорилируется в АТФ, так что освобождающаяся в реакции ГДФ может вновь фосфорилироваться. Таким образом энергия, выделяющаяся при окислении α-кетоглутарата, частично накапливается сначала в сукцинил-КоА и затем переносится через ГТФ на АТФ. Эта реакция является примером субстратного фосфорилирования. В α-кетоглутуратдегидрогеназной системе, следовательно, происходит образование 1-ой молекулы АТФ путем субстратного фосфорилирования и 3-х молекул АТФ путем окислительного фосфорилирования. Образовавшаяся янтарная кислота превращается в фумаровую кислоту.

Реакция катализируется ферментом сукцинатдегидрогеназой. Этот фермент очень активен во всех клетках, обладающих способностью поглощать кислород. Он прочно фиксирован в структуре митохондрий. Сукцинатдегидрогеназа в качестве простетической группы содержит производное флавина (ФАД) и кроме того – 4 атома негиминового железа. Восстановленный ФАД в последующем окисляется в дыхательной цепи с выделением энергии, аккумулируемой в процессе окислительного фосфорилирования в 2-х молекулах АТФ. Сукцинатдегидрогенза обладает свойствами аллостерического фермента, она активируется фосфатом, сукцинатом и фумаратом и конкурентно ингибируется оксалоацетатом – последней дикарбоновой кислотой лимоннокислого цикла, накопление которой выше определенного уровня тормозит сукцинатдегидрогеназную реакцию.

Фумаровая кислота, образовавшаяся в результате окисления янтарной кислоты, с помощью фермента фумаратгидратазы превращается далее в яблочную кислоту. Этот фермент очень специфичен, действует стереоспецифически, образуя только L‑яблочную кислоту. Реакция легко обратима.

Хотя реакция носит эндергонический характер, тем не менее в клетке она идет в прямом направлении, так как её продукты (оксалоацетат и восстановленный НАД) быстро удаляются. Оксалоацетат вступает в реакцию с новой молекулой ацетилкоэнзима-А, включающегося в лимоннокислый цикл, а НАД.Н₂ окисляется в дыхательной цепи с аккумуляцией выделившейся энергии в 3-х молекулах АТФ.

Следовательно, с образованием вновь молекулы оксалоацетата цикл замыкается и по существу идет окисление ацетильных остатков, постоянно вносимых в лимоннокислый цикл в виде ацетилкоэнзима-А.

Следует подчеркнуть, что лимоннокислый цикл – это каталитический механизм, при помощи которого осуществляется полное окисление не только ацетил-Ко-А и всех соединений, способных его образовать, но так же любого компонента цикла или любого соединения, способного превратиться в один из компонентов цикла. К примеру, существуют ферментативные реакции, обеспечивающие превращение некоторых аминокислот в субстраты лимоннокислого цикла: α‑кетоглутарат, сукцинат, оксалоацетат и фумарат. Жирные кислоты с нечетным числом углеродных атомов превращаются через пропионил-КоА в сукцинил-КоА.

Все реакции лимоннокислого цикла более или менее обратимы. Однако, основное направление лимоннокислого цикла – его протекание в сторону образования щавелево-уксусной кислоты из лимонной через стадии цисаконитовой, изолимонной, щавелево-янтарной, α‑кетоглутаровой, сукцинил‑КоА, янтарной, фумаровой и яблочной кислот.

Благодаря наличию лимоннокислого цикла и сопряженной с ним дыхательной цепи происходит полное окисление уксусной кислоты (ацетилкоэнзима-А) до СО₂ и Н₂О с образованием 205 ккал (858,8 кДж) свободной энергии.

В лимоннокислом цикле декарбоксилирование происходит на двух стадиях превращений: щавелево-янтарная кислота – α‑кетоглутаровая кислота и α‑кетоглутаровая кислота – сукцинил-КоА, что приводит к образованию 2-х молекул СО₂.

Необходимое количество молекул воды (а именно 2 молекулы) включается в двух реакциях гидратации (фумаровая кислота – яблочная кислота и цитрил-КоА – цитрат).

Прирост свободной энергии происходит в основном в четырех реакциях дегидрирования, которые поставляют основную часть энергии, благодаря последующему окислению водорода в дыхательной цепи. Это следующие реакции:

1) изолимонная – щавелево-янтарная кислоты;

2) α-кетоглутаровая – янтарная кислоты;

3) янтарная – фумаровая кислоты;

4) яблочная – щавелево-уксусная кислоты.

При окислении в лимоннокислом цикле в реакциях, сопряженных с дыхательной цепью ферментов одной молекулы уксусной кислоты в виде ацетил-КоА образуется 12 молекул АТФ. Образование их происходит в уже указанных реакциях дегидрирования с последующим окислением атомов водорода в дыхательной цепи:

1) изолимонная кислота – щавелево-янтарная кислота – 3 мол. АТФ;

2) α-кетоглутаровая кислота – янтарная кислота – 4 мол. АТФ;

3) янтарная кислота – фумаровая кислота – 2 мол. АТФ;

4) яблочная кислота – щавелево-уксусная кислота – 3 мол. АТФ.

При окислении α-кетоглутаровой кислоты происходит образование 1 молекулы АТФ путем субстратного фосфорилирования и 3 молекул АТФ путем окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи. При окислении янтарной кислоты выпадает одно фосфорилирование, так как водород субстрата переносится непосредственно на убихинон (Ко-Q, дыхательной цепи), поэтому при этой реакции образуется 2 молекулы АТФ.

Весь процесс лимоннокислого цикла можно представить в виде схемы:

цитратсинтаза аконитаза

ацетил-КоА + оксалоацетат цитрил-КоА+ Н₂О цитрат

КоА -Н₂О

аконитаза изоцитратдегидрогеназа

+Н₂О декарбоксилирующая, НАД, Mg^{2 +}

цис-аконитат изоцитрат

НАД·Н₂

изоцитратдегидрогеназа
a- кетоглутаратдегидрогеназа

декарбоксилирующая, ТПФ,ЛК,КоА,ФАД,НАД,Mg²⁺

оксалосукцинат a-кетоглутарат

СО₂ НАД·Н₂ + СО₂

сукцинилтиокиназа сукцинатдегидрогеназа

+ГДФ,Ф,Mg²⁺ +ФАД

сукцинил-КоА сукцинат

ГТФ+АДФ®АТФ+ГДФ ФАД·Н₂

фумаратгидратаза малатдегидрогеназа

+Н₂О +НАД

фумарат малат оксалоацетат

НАД·Н₂

Итак, четыре пары атомов водорода, снятые с субстратов в лимоннокислом цикле, передаются с НАД.Н₂ или ФАД.Н₂, на дыхательную цепь, локализованную, как и лимоннокислый цикл, в митохондриях. В конечном счете все четыре пары атомов водорода превращаются в ионы Н⁺ и соответствующее число электронов (т.е. протоны и электроны) и переносятся по дыхательной цепи на кислород. Следовательно, лимоннокислый цикл, во-первых, функционирует только в аэробных условиях и сопряжен с дыхательной цепью ферментов, а во-вторых, служит главным донором (генератором) водорода для дыхательной цепи. Надо заметить, что кроме лимоннокислого цикла – основного поставщика водорода для дыхательной цепи, в организме функционируют вспомогательные дегидрогеназные реакции, которые выполняют функцию доноров атомов водорода для дыхательной цепи. Это отдельные реакции окисления жирных кислот, глюкозы, пирувата, глутамата, глицерофосфата.

Дата добавления: 2014-01-05