Выделение ферментов

Вся информация об отдельных метаболических реакциях, о промежуточных соединениях, образующихся на последовательных этапах различных метаболических путей, а также о механизме регуляции работы катализаторов получена главным образом с использованием очищенных препаратов ферментов. Высокоочищенные препараты ферментов необходимо иметь также и для того, чтобы получить надежные данные о кинетике, кофакторах, активных центрах, о структуре и механизме действия ферментов.
Процесс очистки состоит в выделении данного фермента из грубого клеточного экстракта, содержащего множество других компонентов. Небольшие молекулы удаляются диализом или гель-фильтрацией; нуклеиновые кислоты — осаждением путем добавления антибиотика стрептомицина и т.д. Основная проблема—отделить нужный фермент от сотен химически и физически сходных белков.
Классические методы очистки

Широко используются следующие методы очистки: осаждение при различных концентрациях солей (чаще всего сульфата аммония или сульфата натрия), а также органическими растворителями (ацетоном, этанолом); дифференциальная денатурация путем нагревания или изменения рН; дифференциальное центрифугирование, гель-фильтрация и электрофорез.
Для масштабной и быстрой очистки белков успешно применяются избирательная адсорбция и элюция белков с целлюлозного анионообменника диэтиламиноэтилцеллюзлозы и катионообменника карбоксиметилцеллюлозы. Широко используется также разделение белков по размерам на молекулярных ситах, например сефадексе. Эти методы являются, однако, относительно малоселективными (если они не используются в сочетании) для отделения индивидуального белка от всех остальных, находящихся в смеси. Такая задача легче решается методом аффинной хроматографии.
Типичная процедура очистки одного из ферментов печени с хорошим выходом и 490-кратной степенью очистки препарата описана в табл. 7.2. Обратите внимание на изменение при очистке удельной активности и выхода фермента. Процедура направлена на то, чтобы достичь максимальной удельной активности (число единиц активности фермента на 1 мг белка) при возможно большем выходе исходной суммарной активности.
Метод аффинной хроматографии
Замечательным достоинством этого метода очистки является то, что он позволяет избирательно извлекать из сложной смеси белков один конкретный белок или по крайней мере небольшое их число. Метод основан на использовании иммобилизованного лиганда, который специфически взаимодействует с тем белком, который требуется пблучить в очищенном виде. Из всех белков, присутствующих в смеси, с этим иммобилизованным лигандом связываются только те белки, которые способны вступать с ним в сильное взаимодействие. После удаления всех прочих несвязавшихся белков нужный фермент элюируют с иммобилизованного лиганда либо концентрированными солевыми растворами, либо раствором, содержащим растворимую форму лиганда. Успешное применение метода аффинной хроматографии позволяет добиться в ходе очистки поразительных результатов, обычно превосходящих результаты последовательного применения многочисленных классических методов.
Чаще всего ферменты проявляют высокую специфичность по отношению к своим субстратам и ко-ферментам, поэтому наиболее подходящими лиган-дами служат производные субстратов и кофермен-тов, ковалентно связанные с носителем, например с сефадексом. Они могут быть присоединены к носителю либо непосредственно, либо через связующую «ножку» (линкер) из 3—8 атомов углерода. Использование линкера помогает разрешить проблемы, связанные с тем, что присоединение лиганда к носителю может препятствовать его взаимодействию с ферментом. Вместе с тем введение гидрофобного линкера иногда осложняет выделение из-за проявления эффектов хроматографии на гидрофобных ли-гандах (см. ниже). Примером успешного применения аффинной хроматографии может служить очистка множества различных дегидрогеназ на аффинных
носителях с NAD⁺ в качестве лиганда. При этом с лигандом могут связываться несколько дегидрогеназ, которые при элюировании их раствором NAD* выходят вместе, и их дальнейшее разделение проводят, используя уже не коферментные, а субстратные аффинные носители или применяя для элюирования «тупиковые тройные смеси», содержащие кофер-мент, специфический субстрат и специфический продукт.
С аффинной хроматографией во многом сходна хроматография, при которой в качестве лигандов используются красители (голубая, зеленая или красная сефароза), а также хроматография на гидрофобных лигандах, где носителем является октил- или фенилсефароза. В первом случае в качестве иммобилизованного лиганда используют органический краситель, являющийся аналогом субстрата, кофермента или аллостерического эффектора. Элюирование обычно осуществляют солевым раствором увеличивающейся концентрации.
В случае хроматографии на гидрофобных лигандах к носителю (например, сефадексу) присоединяют алкильные или арильные углеводороды. Связывание белков с такими носителями обусловлено гидрофобными взаимодействиями между алкильными цепями и гидрофобными участками белковой молекулы. Белки наносят в составе растворов с высоким содержанием соли, например (NH₄)₂ S0₄. и элюируют раствором с понижающейся концентрацией этой же соли.
Определение гомогенности белкового препарата с помощью электрофореза в полиакриламидном геле
Гомогенность белковых препаратов лучше всего устанавливать с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в разных условиях. При одномер-ном электрофорезе нативного белка (при наличии достаточного количества препарата) можно обнаружить как основные, так и минорные белковые примеси. В двумерном варианте (по О'Фаррелу) в одном направлении проводят разделение денатурированных белков в соответствии с их значениями pi (в присутствии мочевины) в градиенте рН, который создается полимеризованными амфолитами. Во втором направлении белки, денатурированные с помощью додецилсульфата натрия, разделяют в соответствии с размерами протомеров (если белок является олигомером).
ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ
Пространственное распределение и клеточная компартментация ферментов, субстратов и кофакторов (см. гл. 2) имеют кардинальное значение. Например, в клетках печени ферменты гликолиза локализованы в цитоплазме, а ферменты цикла лимонной кислоты — в митохондриях.
Распределение ферментов по субклеточным орга-неллам изучают после предварительного фракционирования клеточных гомогенатов путем высокоскоростного центрифугирования, определяя содержание ферментов в каждой фракции. Локализацию данного фермента в ткани или клетке часто удается установить in situ гистохимическими методами («гистоэнзимология»). Для этого тонкие (от 2 до 10 мкм) срезы замороженной ткани обрабатывают раствором субстрата, к которому специфичен данный фермент. В тех местах, где находится фермент, образуется продукт катализируемой этим ферментом реакции. Если продукт окрашен и нерастворим, он остается на месте образования и позволяет локализовать фермент. Гистоэнзимология дает наглядную и в известной мере физиологичную картину распределения ферментов.
ИЗОФЕРМЕНТЫ (ИЗОЗИМЫ)
Когда мы говорим «малатдегидрогеназа» или «глюкозо-6-фосфатаза», то обычно имеем в виду конкретный белок, обладающий форментативной активностью, однако в действительности эти наименования охватывают все белки, катализирующие окисление малата в оксалоацетат или гидролиз глю-козо-6-фосфата с образованием глюкозы и Р_;. В частности, после выделения малатдегидрогеназы из различных источников (печени крысы, Е. coli) обнаружилось, что ферменты из печени и фермент из Е. coli, катализирующие одну и ту же реакцию, различаются во многих отношениях по своим физическим и химическим свойствам. Физически различимые формы ферментов, обладающие одним и тем же видом каталитической активности, могут присутствовать
в разных тканях одного организма, в разных типах клеток одной ткани и даже в прокариотическом организме, например в Е. coli. Это открытие было сделано благодаря применению электрофоретических методов разделения белков, в результате чего были обнаружены электрофоретически разные формы определенной ферментативной активности.
Термин «изофермент» («изозим») охватывает все вышеупомянутые физически различимые белки с данной каталитической активностью, однако на практике, и особенно в клинической медицине, его употребляют в более узком смысле, подразумевая физически различимые и поддающиеся разделению формы данного фермента, присутствующие в различных типах клеток данного эукариотического организма, например человека. Изозимы неизменно обнаруживаются в сыворотке и в тканях всех позвоночных, насекомых и в одноклеточных организмах. При этом число ферментов и их содержание сильно варьируют. Известны изоферментные формы дегидрогеназ, оксидаз, трансаминаз, фосфатаз, трансфос-форилаз и протеолитических ферментов. В различных тканях могут находиться разные изоферменты, и эти изоферменты могут иметь неодинаковое сродство к субстратам.
Диагностическое значение изозимов
Медицинский интерес к изозимам возник после того, как было обнаружено, что сыворотка человека содержит несколько изозимов лактатдегидрогеназы и что их относительное содержание значительно изменяется при определенных патологических состояниях. Впоследствии было выявлено много других случаев изменения относительного содержания изозимов при разных заболеваниях.
Изозимы сывороточной лактатдегидрогеназы обнаруживаются после электрофореза при рН 8,6 на крахмальном, агаровом или полиакриламидном гелях. При указанном значении рН изозимы несут разный заряд и распределяются на электрофореграмме в пяти разных местах. Далее изозимы можно обнаружить благодаря их способности катализировать восстановление бесцветных красителей в нерастворимую окрашенную форму.
Типичный набор реагентов для обнаружения изозимов дегидрогеназы включает:
1) восстановленный субстрат (например, лактат);
2) кофермент (NAD⁺);
3) краситель в окисленной форме (например, голубая нитротетразолиевая соль);
4) переносчик электронов от NADH к красителю [например, феназинметасульфат (ФМС)];
5) буфер; активирующие ионы (если требуются). Лактатдегидрогеназа катализирует перенос двух
электронов и одного иона Н⁺ от лактата к NAD⁺

ФЕРМЕНТЫ В КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ
Различия между функциональными и нефункциональными ферментами плазмы
Некоторые ферменты, проферменты и их субстраты в норме постоянно циркулируют в крови человека и выполняют физиологические функции. Примерами функциональных ферментов плазмы являются липопротеинлипаза, псевдохолинэстераза, а также проферменты компонентов систем свертывания крови и растворения кровяного сгустка. Они синтезируются в печени, и их концентрация в крови либо такая же, как в тканях, либо более высокая.
Как следует из названия, нефункциональные ферменты плазмы не выполняют в крови никаких известных физиологических функций. Их субстраты в плазме обычно не обнаруживаются, и в норме их концентрация в крови человека почти в миллион раз ниже, чем в тканях. Появление этих белков в плазме в повышенных концентрациях указывает на повышенную скорость деструкции тканей. Если электрофореграмму опрыскать приведенной выше смесью и затем инкубировать при 37°С, то реакция сопряженного переноса электронов будет протекать только в тех местах, где присутствует лактатдегидрогеназа. Относительную плотность окраски полос можно далее оценить количественно с помощью сканирующего фотометра. Изозим с наибольшим отрицательным зарядом обозначают I,.
Физическая природа изозимов
Олигомерные ферменты, образованные разными протомерами, могут быть представлены несколькими формами. Часто определенная ткань продуцирует преимущественно один из протомеров. Если активный олигомерный фермент (например, тетрамер) может быть построен из таких протомеров в различных комбинациях, то образуются изозимы.
Изозимы лактатдегидрогеназы различаются на уровне четвертичной структуры. Олигомерная молекула лактатдегидрогеназы (мол. масса 130000) состоит из четырех протомеров двух типов, Н и М (оба с мол. массой около 34000). актив-
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Из всех тех факторов, от которых зависит определение активности фермента — концентрация фермента и субстрата, температура, рН и присутствие ингибиторов,— наибольший клинический интерес представляют последние три. Активность ферментов растет с повышением температуры, поэтому скорость метаболических процессов значительно повышается при лихорадке. Если температура в конце концов не понизится, последствия будут фатальны. С другой стороны, понижение температуры тела (гипотермия)— и, следовательно, понижение активности большинства ферментов—весьма полезно в тех случаях, когда требуется снизить общие метаболические потребности (например, при операции на сердце или транспортировке органов для трансплантационной хирургии). Кардинальным биологическим принципом является гомеостаз — поддержание внутренней среды организма в состоянии, максимально близком к норме. Активность многих ферментов и белков изменяется даже при сравнительно небольших изменениях рН. Большинство лекарственных препаратов оказывает свое действие, влияя на соответствующие ферментативные реакции. Многие такие препараты сходны с природными субстратами и потому могут действовать как конкурентные ингибиторы ферментов. Чтобы понять многие процессы, которые существенны для фармакологии.

РОЛЬ КАТАЛИЗАТОРОВ В ОБРАЗОВАНИИ ПРОДУКТИВНЫХ ПЕРЕХОДНЫХ СОСТОЯНИЙ
Рассмотрим профили реакций, различающихся только образованием двух разных переходных состояний. В обоих случаях величина свободной энергии образования переходного состояния характеризует энергетический барьер полной реакции. Но энергетический барьер реакции, проходящей через переходное состояние [Y-R-■Х]^ь, ниже, чем энергетический барьер реакции, проходящей через переходное состояние [Y-R-X]⁸. В приведенном выше примере [Y-R-Х]^а представляет собой переходное состояние некатализируемой реакции, тогда как [Y---R-X]^b— это переходное состояние катализируемой реакции. Все катализаторы, включая и ферменты, уменьшают свободную энергию образования переходного состояния AG_F. Заметим далее, что на величину AG катализатор не влияет: изменение свободной энергии полной реакции не зависит от присутствия катализаторов. Константа равновесия химической реакции является функцией изменения стандартной свободной энергии этой реакции:
AG⁶ = - RT In К «г
Отсюда следует, что ферменты и другие катализаторы не влияют на константу равновесия реакции.

ТЕОРИЯ СТОЛКНОВЕНИЙ
Кинетическая теория, или теория столкновений.
основывается на двух ключевых положениях.
1. Для протекания реакции молекулы должны сталкиваться друг с другом, т.е. сближаться на расстояния, достаточные для образования связей.
2. Чтобы столкновение было продуктивным (т.е. приводило к протеканию реакции), реагирующие молекулы должны обладать энергией, достаточной для преодоления энергетического барьера.
Отсюда следует, что при наличии у реагирующих молекул достаточной энергии все факторы, повышающие частоту их столкновений, будут повышать скорость реакции. И наоборот, факторы, понижающие частоту столкновений молекул или их кинетическую энергию, снижают скорость реакции.
Если не все молекулы в популяции обладают энергией, достаточной для осуществления реакции, то повышение температуры, сопровождающееся увеличением кинетической энергии молекул, приведет к повышению скорости реакции. Эти положения схематически иллюстрирует рис. 8.4. В случае А ни одна из молекул, в случае Б —часть, а в случае В —все молекулы обладают кинетической энергией, достаточной для преодоления энергетического барьера.
Энергетический профиль реакции замещения, для
которой характерно положительное изменение свободной
энергии (Д С > 0). Энергетический барьер
полняет функцию катализатора (т.е. он требуется лишь в следовых количествах и возвращается в исходное состояние по окончании реакции), в каждой из полуреакций фермент выступает как стехиометри-ческий реагент (т. е. реагирует с другими реагентами в молярном отношении 1:1).
Многие другие биохимические реакции можно рассматривать как частные случаи реакций переноса, в которых отсутствуют либо А, либо D, либо оба реагента. Так, реакцию изомеризации (например, взаимопревращение глюкозо-6-фосфата и глюкозо-1-фосфата) можно представить как реакцию переноса, в которой отсутствуют D и А:
В отсутствие ферментов многие химические реакции при температуре, характерной для живых клеток, идут исключительно медленно. Однако даже и при этой температуре молекулы находятся в движении и сталкиваются друг с другом. Правда, они не могут реагировать быстро, поскольку большинство из них не обладает достаточной кинетической энергией для преодоления энергетического барьера. При достаточно большом повышении температуры (т.е. при повышении кинетической энергии) реакция пойдет быстрее. То, что реакция вообще идет (т.е. протекает самопроизвольно), следует из условия AG<0, но при низких температурах она идет медленно. Ферменты ускоряют реакции, протекающие самопроизвольно при условиях, преобладающих в живых клетках.
РОЛЬ ФЕРМЕНТОВ В РАЗРЫВЕ И ОБРАЗОВАНИИ КОВАЛЕНТНЫХ СВЯЗЕЙ
Большинство химических реакций, представляющих биохимический интерес, сопряжено с разрывом или образованием ковалентных связей. Рассмотрим, например, реакцию переноса, о которой говорилось в гл. 7:
D-G + A«±A-G + D,
в которой группа G переносится с донора, D — G, на акцептор А. Полная реакция включает как разрыв связи D — G, так и образование новой связи, А — G. Однако если реакция переноса катализируется ферментом, ее лучше записывать следующим образом:
-у ^Enz у"⁴
Ч-Enz-S^
В таком представлении, однако, теряется из виду еще одно ключевое свойство ферментативных реакций— участие в полной реакции двух и более форм комплекса Enz — S и последовательное протекание нескольких стадий реакции. Из всего сказанного выше ясно, что для протекания реакции необходимо, чтобы все участвующие в ней реактанты сближались на расстояния, достаточные для образования (или для разрыва) связей, т. е. сталкивались друг с другом. В химии гомогенных растворов концентрация реагирующих молекул в отсутствие катализаторов считается постоянной во всем растворе. Однако в присутствии катализатора это условие перестает соблюдаться. Для эффективной работы катализатор должен иметь на своей поверхности участки связывания реагирующих молекул. Такое связывание представляет собой обратимый процесс, однако равновесие сильно сдвинуто в сторону образования комплекса. Качественно это можно представить следующим образом:
Реактант + Катализатор +± Комплекс реактанта с катализатором.
Прочность комплекса реактанта R и катализатора С можно охарактеризовать количественно с помощью константы диссоциации комплекса R — С (К_й)
D-G -х^- Еп2 «*-_N^*-
A-G А
Такое ее представление подчеркивает три важных признака ферментативных реакций переноса групп.
1. Каждая полуреакция сопровождается и разрывом, и образованием ковалентной связи.
2. Фермент является равноправным реагентом, таким же как D — G и А.
3. В то время как в полной реакции фермент вы-или константы равновесия реакции: R - С *± R + С.
+ i> К,= [Щ[С] [R-C]
Таким образом, чем прочнее комплекс R — С, тем меньше К_й.
Отсюда мы получаем одно важное следствие: связывание реактанта с катализатором приводит к заметному повышению локальной концентрации реагента по сравнению с его концентрацией во всем растворе. Таким образом, мы переходим из области химии гомогенных растворов в область химии гетерогенных растворов.
Если катализатор биомолекулярной реакции (идущей с участием двух реактантов) связывает оба реактанта, то локальная концентрация каждого из них повышается, причем степень этого повышения зависит от сродства катализатора к данному реак-танту (А!,,). Как мы увидим ниже, скорость бимолекулярной реакции пропорциональна концентрации обоих реактантов, А и В, поэтому связывание А и В с катализатором может приводить к чрезвычайно большому (в несколько тысяч раз) увеличению скорости реакции.
Одним из ключевых факторов, позволяющих ферменту служить катализатором, является его способность эффективно связывать один или (чаще) оба реактанта, участвующие в бимолекулярной реакции, что приводит к повышению локальной концентрации реактантов и, следовательно, к локальному повышению скорости реакции. То обстоятельство, что ферменты по сравнению с большинством небелковых катализаторов необычайно эффективны и высокоизбирательны, требует дальнейшего объяснения. Чтобы понять эти отличительные свойства ферментов, мы должны ввести понятие активного, или каталитического, центра ¹.
КАТАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

Размеры белков намного превышают размеры низкомолекулярных субстратов, в связи с чем возникло представление о том, что в катализе участвует лишь ограниченная область молекулы фермента. Эту область мы и называем каталитическим центром. Вначале было непонятно, почему молекулы ферментов столь велики, если только часть их структуры участвует в связывании субстрата и непосредственно в катализе. Однако, как показал анализ трехмерной структуры ферментов, с субстратом взаимодействует намного большая часть белковой молекулы, чем предполагалось ранее. Если еще учесть включение в работу ферментов аллостерических центров такого же размера (см. гл. 10), не приходится удивляться объемности ферментов.
Модель «ключ—замок» Первоначальная модель каталитического центра, предложенная Эмилем Фишером, трактовала взаимодействие субстрата и фермента по аналогии с системой «ключ — замок». Эта модель, которую иногда называют моделью «жесткой матрицы», не утратила своего значения для понимания некоторых свойств ферментов, например их способности к строго определенному связыванию двух или большего числа субстратов (рис. 8.6), или для объяснения кинетики насыщения субстратом.
Модель индуцированного соответствия
Недостатком модели Фишера является подразумеваемая в ней жесткость каталитического центра. Более общий характер имеет модель индуцированного соответствия, предложенная Кошландом. Эта модель основывается на весьма убедительных экспериментальных данных. Ее существенной чертой является гибкость каталитического центра. В модели Фишера каталитический центр считается заранее подогнанным под форму молекулы субстрата. В модели
¹ Во многих руководствах понятия «активный центр» и «каталитический центр» рассматриваются как синонимы, однако некоторые ферменты имеют дополнительные «активные центры», предназначенные для регуляции активности фермента и непосредственно не связанные с химическими превращениями на различных стадиях каталитического процесса. Поэтому, чтобы избежать неоднозначности, мы используем термин «каталитический центр».

Дата добавления: 2014-01-06