Білкова інженерія

Використання методів генетичної інженерії в створенні ферментних препаратів

Для отримання продуцентів використовують:

- селекція

- мутагенез

- генетично-інженерні методи

Генна інженерія. Три напрямки:

- збільшення копійності генів

- використання сильних промоторів

- модифікація білків

Збільшення копійності генів – це використання багатоколійних плазмід, які вводять в продуцент.

Модифікація білків:

1). Модифіковані ферменти отримують сайт-спрямованим мутагенезом вихідних генів, тобто заміна однієї або декількох амінокислот на рівні генів.

Для цього in vitro хімічно синтезують необхідну ДНК-послідовність і цю послідовність вбудовують в необхідний ядерний геном продуценту або в плазміду, яку вносять в продуцент.

Приклади:

- якщо в молекулі фосфоліпази замінити аспарагін на аспарагінову кислоту та глутамін на лізин, то підвищується специфічна активність даного ферменту.

- заміна однієї амінокислоти тирозину тРНК-синтази в Bacillus збільшила спорідненість цього ферменту до АТФ в 100 разів.

- заміна амінокислоти на інші, що призводить до збільшення термостабільності, до граничних значень рН, це досягається змінами третинної структури, яка обумовлена сульфгідридними зв’язками (цистеїн або додається, або забирається).

2). Модифікація ферменту також здійснюється за допомогою вбудовування або виключення субстрат зв’язуючого домену ферменту (замінюється послідовність амінокислот). Приклад: в результаті введення в молекули глікозилтрансферази, целюлозозв’язуючого домену, фермент набуває здатності зшивати розриви молекул в аморфних ділянках целюлози.

3). Конструювання гібридних молекул полягає в створенні гена, що складається з ділянок, що кодують функціональні домени двох близьких або різних білків. В результаті розширюється субстратна специфічність, або 2 біохімічні ланцюга поєднуються в один.

Конструювання таких гібридних молекул здійснюють за допомогою:

- трансдукція

- класична трансформація

- кон’югація

- метод злиття протопластів

Продуцент – E. coli

Продукуються ферменти як бактеріальні, так і грибні.

Також використовують бактерії: Bacillus subtilis, гриби: Asp.niger, Thrihoderma.

Отримані продукти (рекомбінантні ферменти) мають більшу чистоту; легше виділяються та очищуються; мають кращі фізико-хімічні властивості; вищу активність.

Білкова інженерія – комплекс методичних заходів, які дозволяють реконструювати молекулу білку, шляхом спрямованого введення певних мутацій в структурний ген. Тобто заміна амінокислот в білку.

Білкова інженерія вирішує завдання:

1). Зміна структурних властивостей білку (підвищення стабільності в органічних розчинниках, підвищення термостабільності, модифікація специфічності зв’язування лігандів, зміна внутрішньо молекулярної динаміки білку).

2). Зміна специфічності ферментів та їх каталітичних характеристик (зміна рН оптимуму, зменшення константи Міхаеліса-Менте, підвищення швидкості каталізу, видалення сайту інгібіювання).

3). Створення нових білкових систем (химерні та мультифункціональні білки, введення фрагментів для полегшення очищення білків).

4). Підвищення ефективності білків як терапевтичних макромолекул для застосування у фармакології і медицині.

Головні напрямки білкової інженерії:

1. Структурно-функціональний аналіз білків методами сайт-специфічного мутагенезу.

2. Випадковий мутагенез, з наступною селекцією білків з певними функціями (молекулярна еволюція).

3. Створення штучних білків de novo.

4. Створення химерних та мультифункціональних білків.

Сайт-специфічних аналіз та сайт-специфічний мутагенез

- спочатку визначають точну нуклеотидну послідовність тієї ділянки ДНК, яка відповідає мРНК, що потребує зміни

- далі визначають які саме зміни необхідно провести

- проведення змін

Принципова схема введення мутації в структурний сайт білку

1). Ген відповідного білку виділяють або синтезують і вбудовують в одноланцюгову ДНК ага М13 або відповідну плазміну.

2). Синтезують олігонуклеотидний фрагмент цього гену, в якому змінений кодон для однієї амінокислоти, яку потрібно замінити. Такий олігонуклеотид називається мутатор, складає 12-20 нуклеотидів.

3). Олігонуклеотид – мутатор поєднують з фагом М13 (або плазмідою). При цьому відбувається часткове з’єднання комплементарних ДНК, в середовище додається ДНК-полімераза та ДНК-лігаза, які добудовують ДНК з утворенням гетеродуплексу, що містить початкову ДНК та мутантну ДНК.

4). E. coli трансформують таким гетеродуплексом і отримують клони, що несуть як нормальні так і мутантні гени білку.

5). Відбирають клони мутантів використовуючи гібридизацію міченого радіоактивного фосфору олігонуклеотиду-мутатора з ДНК мутанта.

Частота мутації – від 1 до 50%.

Цим методом крім точкових замін можна проводити делеції, вставки, інверсії, злиття генів.

Цими ж методами можна проаналізувати функції білку; проаналізувати механізм каталітичної активності (замінити одну амінокислоту і подивитись чи буде білок виконувати свої функції).

Білкова інженерія крім генно-інженерних методів також застосовує рентгеноструктурний аналіз, ЯМР-спектроскопію, біосенсор.

Об’єкти білкової інженерії:

- E. coli

- Sacch. cerevisiae

Білкова інженерія займається ферментами, цитокінами, антитілами, клітинними рецепторами, імуномодуляторами та протипухлинними білками, білками здатними нейтралізувати певні сполуки та м/о, створення нових варіантів біосенсорів.

Дата добавления: 2014-01-07