Перспективи одержання продуцентів етанолу, пива, вина. Генетика і генетична інженерія дріжджів

Головний продуцент спирту - Sacch. cerevisiae.

Переваги використання дріжджів:

-достатньо велика кількість субстратів

- культивування в умовно стерильних ферментерах

- гарний об’єкт для генетичної інженерії

Недоліки дріжджів:

- конкуренція в процесі бродіння та дихання

- чутливість до підвищених концентрацій етанолу

- відсутність ферментів, що каналізують розщеплення крохмалю, целюлози та ксилози

Тому при виробництві пива є стадії виробництва сусла. При виробництві етанолу – стадії оцукрювання крохмалю з використанням препаратів амілаз.

Щоб усунути ці недоліки:

1). Проведення процесу в анаеробних умовах

2). Попередній гідроліз субстратів до моно- та дицукрів

3). Використання традиційної селекції для обрання найкращих продуцентів

Для того щоб підвищити ще в декілька разів потрібно використовувати генно-інженерні методи.

Генетичний апарат дріжджів

Sacch. cerevisiae. Генетичний апарат складається з 16 хромосом.

Всього геном – 14 млн нуклеотидних пар.

Містить в основному унікальні послідовності і до 5 % повторювані.

Наявна мітохондріальна ДНК (кільцеві молекули розміром 25 мкм, 20-70 копій).

В геномі дріжджів наявні транспозони (4-20 копій). Деякі штами транспозонів не містять. А в лабораторіях отримані варіанти, що містять 35 копій транспозонів.

5,3 т.н.п. – розмір транспозонів.

ЛК_10 (1.11)

Плазміди дріжджів (3 групи):

I – мітохондріальні

II - двомікронні криптичні плазміди

III - трьохмікронні (невідома функція)

II і III – використовують в якості векторів після додавання цільових генів і селективних маркерів.

Двомікронна плазміда (Scp1): в дріжджовій клітині – одна і дуже рідко до 50-ти копій; містить два інвертовані повтори довжиною до 600 н.п. і 2 унікальні області.

Трьохмікронна плазміда – здатна до автономної реплікації.

Мітохондріальна (24мкм): може бути до 40-ка копій.

Методи підвищення продуктивності дріжджів

1. Селекція та ступінчастий добір – розсів на ПС і відбір клонів. Мутагенез – для отримання нових продуктів.

Селекцію здійснюють і з використанням різних середовищ з різним складом, що впливає на регуляцію експресії необхідних ферментів. Якщо дріжджі посіяти на середовище з фосфатами, то індукується синтез кислої фосфатази за рахунок позитивної регуляції на продукт.

2. Гібридизація – схрещування різних рас дріжджів, що мають різні необхідні властивості з отриманням гібриду, що може мати властивості цих двох рас. Негативні фактори: випадковість і невелика ефективність.

Схрещування Sacch. cerevisiae штаму, що використовується для пивоваріння з низькопродуктивним штамом, але здатним до зброджування рафінози. Отримують диплоїдні гібриди, що зброджують рафінозу на 70% від вмісту ПС.

3. Методи генетичного конструювання. Як об'єкт для ген. інж. дріжджі мають ряд переваг:

- відбувається процесінг білків (глікозилювання)

- відсутність екзопротеаз дріжджів

Трансформація дріжджів.

Використовують системи:

1 – протопласт – у суміші з поліетиленгліколем (ПЕГ) і ДНК (плазмідна). Дріжджова клітина обробляється глюкоїнідазою або екстрактом шлункового соку виноградного равлика. Клітинна стінка руйнується. Додається ПЕГ, плазміди і відбувається трансформація. В рідкому середовищі клітинна стінка не регенерується. Отримані протопласти змішують з агаризованим середовищем, виливається в чашки Петрі, де клітини відновлюються. Для адсорбції екзогенної ДНК необхідно ПЕГ та катіони Са. Частота трансформації 10^-7 на протопласт. Отримані протопласти стабільні, маркер не втрачається. Недолік: утворення не тільки диплоїдів, а й поліплоїдів; складність маніпуляції в товщині агару. Процес триває 3 години.

2 – клітини обробляють розчинами солей лужних металів (К, Li, Na, Ru). Клітини стають здатними до поглинання екзо-ДНК без руйнування клітинної стінки. Наявність ПЕГ як індуктора, обов'язкова. Тривалість 2 години.

3 – за допомогою електропорації, коли клітинна стінка обробляється струмом, що сприяє проникненню екзо-ДНК. Тривалість – 10хв. Клітинна стінка не руйнується.

4 – ДНК-гармата – вольфрамові, платинові або золоті (діаметр -0,5-0,65 мкм, швидкість – 500м/с) кульки. Можна одночасно адсорбувати 2 різні плазміди.

Векторні системи для дріжджів

Існує 5 типів дріжджових векторів::
1 – YIp – вектори дезінтеграції – бактеріальні плазміди з включеними в них дріжджовими генами. Вони автономно не реплікуються і є інтегрованими (вбудовуються в хромосоми дріжджів). Як бактеріальні плазміди використовують pBR322 або ряд човникових плазмід (які реплікуються в дріжджах і в E.coli). До плазмід додається дріжджовий маркер. Іноді до таких векторів додають дріжджову послідовність початку реплікації, що надає плазмідам здатність до автономної реплікації і підвищення частоти реплікації. Але такі плазміди при культивуванні в неселективних умовах часто втрачаються. Можуть бути стабілізовані додаванням дріжджових центрамерних ділянок. Тоді такі плазміди називаються мініхромосомою (С-тип). Замість декількох копій в клітині залишається 1 плазміда, але вона розподіляється між дочірніми клітинами при мітозі і мейозі і зберігається при цьому. Вектори інтеграції можуть бути кільцевими і лінійними. Лінійні отримують розрізаними рестриктазами кільцевих плазмід, та додаванням до їх кінців дріжджових теломерних ділянок.

2 – клонуючі YEp – багатокопійні вектрні плазміди на основі плазміди Scp1. В неї вбудовують реплікони з E.coli або Sacch. cerevisiae та селективні послідовності (стійкість до антибіотиків, до токсичних сполук тощо). Наявні в дріжджовій клітині як в позахромосомному, так і в інтегрованому стані, тобто є епісомами. Вони човникові оскільки здатні до реплікації в дріжджах і в E.coli.

Також до клонуючих векторів належать:

3 – YRp – плазміди, створюють шляхом трансформації протопластів Sacch. cerevisiae гібридною плазмідою. Ця плазміда містила в собі ген TRP1 (триптофану) + pBR322. При трансформації протопластів був збільшений рівень трансформації. Це обумовлено тим, що ділянка гену TRP1 містила так звану ARS-послідовність, що кодує область початку реплікації дріжджової хромосоми і сприяє автономній реплікації даної плазміди. Ці плазміди в дріжджових клітинах містяться тільки в позахромосомному стані. Іноді їх називають реплікаторні вектори.

4 – стабільні, молекулярні вектори YCp. Це плазміди, що містять центромерні ділянки хромосом. Мають невелику копійність, але високу стабільність і не втрачаються.

5 – лінійні молекулярні вектори YLp – штучні дріжджові хромосоми, що містять послідовності необхідних генів і теломерні ділянки. Їх отримують найчастіше з плазміди YRp.

Найчастіше використовують YEp вектори. В них вбудовоують сильні промотори, застосовують конститутивні гліколітичні ферментні гени (GAL1 – ген бета-галактозидаза, який знаходиться під катаболітною репресією глюкози).

Приклади використання ген. інж. для дріжджів

1 – комплементація з мутантними генами E.coli. Гени дріжджів при цьому вбудовуються у вектор фагу "лямбда" або pBR322 і клонується в E.coli. При цьому трансформант набуває здатності до росту на певних середовищах. Особливість: в якості об'єкту трансформації використовують мутантні клітини E.coli з мутаціями в регуляторних ділянках, що призводить до збільшення продуктивності.

2 – комплементація з мутантними генами Sacch. cerevisiae. Використовують в якості реципієнту ауксотрофних температурочутливих або радіочутливих мутантів Sacch. cerevisiae. Трансформація клітин дріжджів здійснюється як дріжджовими генами, так і генами інших еукаріот (тварин).

3 – метод прогулянки хромосомою. Фрагмент хромосоми з будь-яким раніше клонованим геном використовують як вихідний, тобто за його допомогою відбирають з банку дріжджових ДНК фрагменти, що частково перекриваються з ним. Визначають ці фрагменти. Вони в свою чергу використовуються для відбору з банку наступних фрагментів, що вже перекриваються з іншими. Здійснюється пошук необхідних генів та визначення їх функції.

ЛК_11 (8.11)

4. Гомологія з клонованими генами інших еукаріотів. В генотипах еукаріотів частина ДНК послідовності дуже схожа з послідовністю ДНК дріжджів. Вважається що це пов'язано з законами еволюції і ці послідовнсоті є одними з найдавніших в геномах. Тому такі послідовності можна використовувати для створення плазмідних конструкцій, які можна вбудовувати в дріжджі і вони будуть мітити гени інших еукаріотів. Крім того цей метод застосувується для наукових досліджень - встановлює функції даного гену та особливості експресії і впливу на фенотип.

5. Посилення експресії гену при клонуванні у мультикопійних плазмідах.

Тобто плазміди містять ген дикого типу без змін і створюються умови. В тому числі обираються плазміди такого типу, щоб було не менше 30 копій в клітині. Трансформовані клони дріжджів інкубують в середовищі, що містить інгібітор в певній концентрації. При цьому клітини, що мають невелику кількість копій плазмід – гинуть, а виживають клітини з великою кількістю плазмід. Їх відбирають і використовують в якості продуцента, але постійно перевіряють.

6. Застосування евікції.

Це спосіб клонування мутантних алелей з метою встановлення отриманої мутації та механізму її утворення. Для цього з дріжджової клітини, що є вже трансформованою, виділяють хромосому (плазміду), обробляють певною рестриктазою, таким чином, щоб лише був один сайт розрізання. При цьому отримують або лінійну плазміду, або плазміду з прилеглою хромосомною ділянкою (якщо плазміда була інтегрованою). Потім проводять лігування і отриманими послідовностями трансформують бактерії і вже в бактеріях шукають або досліджують мутантні алелі.

Практичне використання (приклади)

1. При виробництві пива утворюється надлишок β-глюканів з ячменю, що ускладнює очищення пива. Це виправили використанням штаму S. cerevisiae, що був трансформований YEp-плазмідою, що містила кДНК — β-глюканази та послідовність сигнального пептиду під контролем промотора PGK1. PGK1 – промотор гену 3-фосфогліцераткінази дріжджів. Ці дріжджі продукують ендо- β-глюканазу, що практично повністю утилізує β-глюкани.

2. В S. cerevisiae введено багатокопійну плазміду з геном глюкоамілази виділеним з грибів р. Rhyzopus aбо з S. distaticus. Отримані трансформанти змогли здійснювати розщеплення до дицукрів і моноцукрів без додаткових стадій оцукрювання. Ці штами використовуються у виробництві етанолу з крохмалевмісної сировини.

Значення ГІ в утилізації та переробці відходів

Б/т методи, що застосовуються для утилізації відходів:

1) біодеградація;

2) біоконверсія.

Біодеградація – це розкладання токсичних речовин за допомогою мікроорганізмів найчастіше або ферментів. Біодеградацію застосовують для очищення ґрунтів, ґрунтових і поверхневих вод, а також різних відходів - токсичні відходи (ксенобіотики), наприклад синтетичні хімічні речовини: пестициди, гербіциди, холодоагенти, розчинники, вуглеводні нафти та нафтопродукти.

Основною групою м/о, що здатна до руйнування ксенобіотиків, є Pseudomonas. Біохімічні дослідження показують, що штами Pseudomonas здатні розщеплювати більше 100 ксенобіотиків. При чому один штам часто може розщеплювати декілька сполук, які хімічно споріднені - дикі штами Pseudomonas. Гени, що кодують ферменти здатні до розщеплення, можуть мати як хромосомну локалізацію, так і плазмідну. Плазміди з цими генами мають від 50 до 200 т.н.п. (великі розміри плазміди) і невелику копійність.

Плазміда SAL містить гени для деградації cолідатів – 60 т.п.н.

Плазміда TOL – для деградації толуолу – 113 т.п.н.

pJP1 – 2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота - 85 т.п.н.

CAM – для деградації камфори - 225 т.п.н.

NAH – для деградації нафталіну - 69 т.п.н.

XYL-K – ксилол і толуол – 135 т.п.н.

Гени, що містяться в цих плазмідах позначаються тими ж самими буквами.

Для деградації ксенобіотиків в більшості випадків необхідно декілька ферментів, які поступово перетворюють токсичну сполуку в нетоксичну. Наприклад, ароматичні сполуки без галогенів, як правило перетворюються на катехол або протокатехол, які потім в результаті декількох реакцій окислювального розщеплювання перетворюються на ацетил-КоА і сукцинат або піруват і ацетальдегід. Якщо ароматичні сполуки містять галогени, крім катехолу утворюються гідрохінони та їх галогенпохідні, тому необхідні додаткові етапи дегалогенування, для чого використовують внесення в бактерію плазміди з ферментами диоксигеназами, які заміняють галоген на гідроксильну групу. Дегалогенування може відбуватись на перших етапах деградації, а може – на останніх. Чим більше атомів галогену, тим повільніше відбувається деградація вцілому. Сполуки нетоксичні тільки тоді, коли не містять галогени вцілому.

Основні недоліки диких штамів м/о (Pseudomonas)

1. Жоден штам не може руйнувати велику кількість ксенобіотиків (1 або декілька схожих за хімічною структурою сполук).

2. Ряд органічних сполук у високій концентрації пригнічує життєдіяльність м/о.

3. Велика кількість джерел ксенобіотиків містить складну суміш токсичних сполук і тому м/о може інактивуватися або взагалі втрачати життєдіяльність під дією інших нецільових компонентів.

4. Невисока швидкість біодеградації.

5. Неполярні ксенобіотики добре адсорбуються в ґрунті і стають менш доступними.

Генно-інженерні методи для вирішення цих проблем

Використання плазмід.

В плазміду вбудовують різні гени для розширення спектру сполук, який даний м/о зможе руйнувати. Або використовують різні плазміди, кожна з яких містить ферменти для руйнування однієї сполуки, які поєднують в одному штамі.

В 1970 році створено перший штам Pseudomonas, що розщеплював більшість вуглеводнів нафти. Цей штам містив ряд плазмід, а саме плазміди CAM, XYL-K, NAH. Спочатку шляхом кон´югації плазміду К перенесли в штам, що несе плазміду OCT (деградує октан). Ці 2 плазміди несумісні (не можуть існувати у вигляді окремих плазмід в одній клітині), але вдалося провести рекомбінацію отриманих плазмід з 2 функціями. Схожим шляхом отримали плазміду, що мала гени деградації нафталіну і ксилолу. Отримані 2 плазміди об´єднують в одному штамі. Одержаний штам, здатний до руйнування 4х різних сполук, у великих масштабах не використовується, хоча спрямований на очищення октану від нафти.

Крім розширення спектру дії (сполуки) існує ще мезофільна здатність Pseudomonas: +20 – +40ºС. У відкритих водоймищах температура 0 - +20 ºС. Необхідно одержати штам, здатний до деградації при пониженій температурі. В психрофільний штам Pseudomonas putida (нездатний до деградації ксенобіотику) було внесено TOL і підібрано штам Pseudomonas putida, що утилізує саліцилати при 0ºС. В результаті одержують штам здатний руйнувати 2 сполуки при 0 ºС за умови наявності додаткових джерел вуглецю.

ЛК_12 (15.11)

Метод зміни генів. При цьому проводиться модифікація генів найчастіше розташованих у плазміді.

Було обрано плазміду pwwo що відповідає за розклад толуолу і ксилолу за це відповідає 12 генів. Xyl-оперон що контролює експресію являє собою промотор

. Xyl-оперон: Рm(промотор) xyz-послідовність генів що відповідає за синтез ферментів необхідних для послідовного розщеплення толуолу та ксилолу. Активність транскрипції цього гену знаходиться під позитивним контролем практично всіх метаболітів що утворюються на шляху розкладання ксилолу або толуолу. При цьому бактерії що несуть цю плазміну здатні розщеплювати 4-етилбензоат, проміжний продукт розщеплення не до кате холу а до 4-етил кате холу ця сполука ініктивує один з основних ферментів даного метаболітичного шляху а сам кате хол ін активує 2.3 дезоксигеназу, тому генно інж. Дослідження спрямовані на –по перше запобіганню інактивації цього ферменту і на індукування транскрипції генів цього ксил-оперону у випадку коли єдиним субстратом є 4-етилбензоат а не толуол або ксилол.

Шляхи вирішення цього такі.

Було обрано іншу плазміну в неї вбудовано ген стійкості до ампіциліну та тетрацикліну отримано ще 1 плазміду з геном стійкості до канаміцину і геном Xyl. Цими двома плазмідами трансформовано E.coli. Відібрали позитивні трансформанти з обома плазмідами одночасно, використав. Стійкі до ампіциліну і канаміцину. Додатково обробляють мутагеном (етил метан сульфонал) і провели культивування на середовищі з тетрацикліном і 4-етил бензоатом. Клітини що виросли містять Xyl. Ген і регуляторний білок який дає можливість використовувати 4-етилбензоат як єдиний субстрат. Для запобігання інактивації кате хол 2.3-дезоксигенази було обрано мутантний ген xylS. Його вбудовано в плазміду що несе ген стійкості до канаміцину.Сконструйовану плазміду ввели в культуру Pseudomonas putida, що вже містить плазміду pwwo після чого провели відбір за стійкістю до канаміцину і отримані клітини містили рекомбінантну плазміду завдяки чому штами здатні до синтезу модифікованої кате хол 2.3 –дезоксигенази, що не інгібується етилбензоатом.

Ще один варіант зміни генів є використання інших більш сильних промоторів або модифікації наявного промотора.

Отримання штамів Pseudomonas putida що здатні руйнувати 3-хлоретилен накопичений у воді та грунті., що частково може під дією ґрунтових бактерій перетворюватися на вініл хлорид- є канцерогеном. Для руйнування 3-хлоретилену необхідні всі ті ж самі ферменти що і для розщеплення толуолу та ксилолу або 2-й шлях руйнування, коли необхідний ген толуол дезоксигенази під контолем tac-промотору

todC1,-todC2,todC3,todC4-це 4 ферменти що необхідні для перетворення толуолу або 3-хлоретилену в флавопротеїн що є нетоксичним. Цю конструкцію експресували в E.coli.

tac-промотор-активується ізопропіл β-D-тіогалактопіранозидом внаслідок чого відбувається послідовне в 4 етапи розкладання 4-хлоретилену. Швидкість деградації 3-хлоретилену зо доп. E.coli з такою плазмі дою нижча але плазміни зберігаються набагато довше ніж в Pseudomonas putida.

Схожі конструкції створюються для отримання штамів Pseudomonas putida здатних до руйнування біфенілу. Основний фермент біфініл дезоксигеназа,що складається з 2-х субодиниць. Шлях деградації біфенілу склад. З поступової деградації біфінілдезоксигеназою ферезоксином і ферезоксиредуктазою. Оскільки біфінілдезоксигеназа за структурою і функціями схожа на толуолдезоксигеназу то було замінено ген що кодує велику субодиницю біфінілдиоксигенази. Отримано штам що має вищу ефективність руйнування біфінілу здатний до деградації 3-хлоретилену та здатний рости на більшій кількості субстратів.

Утилізація крохмалю та цукрів

Крохмалвміщ. І цукровміщуючі середовища використ. для виробництва етанолу і фруктози. Основний ферменти гідролізу крохмалю α-амілаза,глюкоамілаза та глюкоізомераза –їх у вигляд. ферм. препаратів викорст. у промисловості. Витрати на ці ферменти 30 % витрат на будь-які ФП взагалі. Виробництво фруктози і етанолу починається з подрібнення зерна або інш. сировини. При цьому найбільш дорогими є наступн етапи на яких використ. ФП

Подрібнену сировину обробляють паром отрим. желеподібний продукт, що охолоджують обробляють α-амілазою, далі оброб. глюкоамілазою отримують оцукрюваний продукт –суміш моно та дицукрів. Якщо на цю суміш подіяли глюкоізомеразою то отрим. фруктозу, якщо використ. дріжджі то етанол.

Основні напрямки підвищення ефективності цих процесів

1. використовувати в якості продуцентів ФП швидкоростучих штамів здатних до утилізації широкого спектру субстратів не дорогих.

2. отримувати α-амілазу з більшою активністю, що дозволило б провести етап зрідження при нижчих температурах +80,90 С, а не більше 100. Це прискор процес і зменш. Час охолодження.

3. Можна модифікувати гени α-амілази і глюкоамілази так щоб отрим. ферм. мали однакові оптимуми рН і температури, що дозволить етапи зрідження та оцукрювання проводити одночасно.

4. знайти або створити ферменти, що ефективно розщеплюють крохмал без попередньої обробки паром.

5. створити м/о що були б здатні до синтезу глюкоамілази. Тобто отрим. дріжджі, що будуть вироб. етанол з розрідженого продукту або з крохмалю.

ЛК_13 (22.11)

Способи оптимізації

1. Виділення гену α-амілази з різних мікроорганізмів, напр. Вacillus amyloliquefaciens, Вacillus stearothermophilus – термофільні м/о, амілази яких діють в інших температурних оптимумах. Ген α-амілази є ядерним, а не плазмідним. Ядерну ДНК з бактерій виділяли обробленням рестриктазою і вбудовували в плазміду pHB110. Маркером в цій плазміді є ген стійкості до канаміцину. Плазміди вносили в Вacillus subtilis. Проводили культивування позитивні трансформанти відбирали на середовищі з канаміцином. А потім відбирали трансформанти здатні до гідролізу крохмалю, відбір здійснювався на середовищі з крохмалем. Після інкубування обробляли розчином йоду: клони, що містили необхідний α-амілази, відбирали за відсутністю синього забарвлення. Такий метод має практичне застосування. Ген, який був відібраний з м/о, додатково модифікували будуванням в інший м/о.

2. Глюкоамілаза. Видалення етапу оцукрювання у виробництві етанолу.

З Aspergillus awamori виділено кДНК глюкоамілази і вбудовували в плазміди S. cerevisiae. Промотор та регуляторна послідовність цієї плазміди були використані з S. cerevisiae.

Плазміду вносили в звичайний штам S. cerevisiae. Отриманий трансформант може перетворювати крохмаль на етанол. Недоліком отриманого штаму була висока чутливість до етанолу, низька експресія глюкоамілази, необхідність постійного відбору клонів з необхідною плазмідою, яка втрачається без відбору. Недоліки вдалося усунути: підвищували експресію гену глюкоамілази видаленням з плазміди послідовності, що відповідає за негативну регуляцію промотора ENO1 (фермент енолаза дріжджова).

Це дозволило підвищити ефективність експресії глюкоамілази більше ніж в 10 раз. Вбудовували послідовність ДНК гетерологічну ділянці дріжджової хромосоми, що перетворило плазміду на інтегрований вектор (має здатність вбудовуватись в дріжджову хромосому). Це призвело до зникнення необхідності відбору.

3. В якості клітини-хазяїна був обраний штам S. cerevisiae стійкий до етанолу (результат промисловий штам).

Іноді в плазміду вбудовують декілька копій генів глюкоамілази з Aspergillus niger, але встановили, що підвищення ефективності більше залежить від місця куди ген вбудований, ніж від кількості копій.

Окремим питанням є використання замість Sacch.cerevisiae Г-негативних бактерій Zimomonas mobilis. Позитивною якістю бактерії є більша швидкість зброджування. Негативні якості: невелика кількість субстратів, які може використовувати бактерія; природна стійкість до поширених антибіотиків, що заважає використовувати в експериментах стандартні маркерні гени стійкості; проблеми підтримки клонуючих векторів широкого кола господарів.

Незважаючи на це, в Z. mobilis вже було вбудовано гени, що дозволяють розширити спектр субстратів (глюкозоізомеразу, ксилулокіназу – для утилізації ксилози; ферменти, необхідні для гідролізу лактози, целюлози, целобіози, крохмалю). Основним недоліком отримання продуценту було те, що вони не могли рости на субстраті з єдиним джерелом вуглецю, необхідні були додаткові компоненти.

Процес силосування

Традиційний метод підвищення ефективності силосування – це додавання препаратів, що містять лактобактерії. Але для нормального розвитку лактобацил необхідно, щоб у субстраті була невелика кількість водорозчинних вуглеводів, а основною сировиною є рослинна (целюлоза, геміцелюлоза, пектин). В основний діючий м/о (Lactobacillus plantarum) було введено ген альфа-амілази, виділений з несилосного штаму L. amilovorus. Отриманий штам з більшою ефективністю силосував рослинну сировину, що містила крохмаль.

Вбудовування різних целюлаз.

Отримання фруктози

Основні ферменти при виробництві фруктоз є глюкоізомерази. Основні реакції цього ферменту це перетворення ксилоз в ксилулозу а необхідна при виробництві реакція перетворення Д-глюкози в Д-фруктозу є побічною при цьому пр наявності хоть невеликої кількості ксилози ізомеризація глюкози у фруктозу не відбувається. Чим більша температура тим більша ступінь ізомеризації глюкози і фруктози. Оптимальна- 160 С тому для збільшення виходу фруктози необхідно підвищити температурний оптимум а з іншого підвищити термостабільність глюкозоізомерази

Наприклад термофільна бактерія Thermus thermophilus.Ген глюкоізомерази був виділений і вбудований в E. Coli I B. Brevis. При цьому використ. різні промотори вбудовані в різні сайти та відібрали штам В. Brevis з продуктивністю цього ферменту більшою в 100 разів ніж у Thermus thermophilus. Можна підвищ активність збільшуючи субстратну специфічність.

Використовують сайт специфічного мутагенезу гену отриманого з Clostridium thermosulfurogenes де було замінено триптофан 139 на фенілаланін, або валін 186 на треонін або одночасно 2 заміни – каталітична активність відносно ксилози знизилазь в 4-5 р. і підвищ. Відносно глюкози в 6 р.

Дата добавления: 2014-01-07