Методи аналізу

Вивчення складу і вмісту цитокінінів в рослинному матеріалі включає ряд етапів: екстракцію, очищення, виявлення цитокінінової активності за допомогою одного або декількох біотестів і кількісну оцінку вмісту сполук з цитокініновою активністю.

Екстракцію цитокініна органічними розчинниками (70 – 95% етанолом, етилацетатом, метанолом) при кислих і лужних рН проводять з свіжого або ліофільно висушеного рослинного матеріалу. Екстракти очищають на колонках з сефадексом, катеонітами (з кислих розчинів) або аніонітами (з лужних розчинів), активованим вугіллям, переосадженням солями срібла, ацетатом барію і іншими способами. Розділення проводять за допомогою паперової тонкошарової хроматографії в різних системах розчинників (наприклад, n-бутанол – оцтова кислота – вода (4:1:1) або n-бутанол – NH₄OH – Н₂О (3:1:1)). Ідентифікацію цитокінінів на хроматограмах проводять по поглинанню в ультрафіолеті при 260 – 275 нм.

Кількісне визначення цитокінінів ускладнено через дуже низький вміст їх в тканинах рослин. Так, для препаративного отримання 1 мг зеатина було потрібно переробити 70 кг незрілого насіння кукурудзи. Для кількісного визначення цитокінінів використовують метод біотестів, а також інфрачервону спектрофотометрію, масспектрометрію, розроблений метод газової хроматографії цитокінінів.

При роботі з рослинним матеріалом після ідентифікації цитокінів на хроматограмах застосовується метод біотестів, що полягає у використанні тканин і органів рослин, позбавлених здатності синтезувати цитокініни. В ізольованому стані ці об'єкти вимагають введення екзогенного цитокініна. Звичайно застосовують 2 – 3 різні біопроби. Як приклад розглянемо 3 групи тестів.

Самими специфічними вважаються біопроби з індукцією цитокінінами поділу клітин в культурі ізольованих стерильних тканин. Використовують калюси серцевинної паренхіми стебла тютюну, сім'ядолі сої, моркви і ін. Через 4 – 5 тижнів визначають приріст сухої маси тканини. Чутливість методу від 1 до 100 мкг/л цитокініна.

Інша група тестів заснована на затримці цитокінінами пожовтіння ізольованого листя. Найчутливішим об'єктом є перший листок зелених проростків ячменю. Пробу проводять таким чином: відрізки основ цього листка поміщають в чашки Петрі з добавкою досліджуваних елюатів з хроматограм або різних концентрацій кінетину для калібрувальної кривої. Чашки виставляють на світло. За 6 – 8 днів в чашках, де не було цитокінінів, листя жовтіє. Там, де цитокініни є, хлорофілу в листку залишається тим більше, чим більша концентрація цитокініна. Хлорофіл визначають колориметричним методом. Мінімальна діюча концентрація для кінетина в цьому тесті складає 1 – 5 мг/л.

В основі третьої групи тестів лежить здатність цитокінінів стимулювати ріст розтягуванням клітин листка. Використовуються висікання із зеленого листя редиски, листя квасолі, гарбузи. Через 3 дні визначають діаметр і сиру масу висікань. Тести цієї групи вимагають також одночасної перевірки дії ауксину і гібереліну.

Дата добавления: 2014-01-07