Одержання безвірусних рослин ін вітро

Перші дослідники, які працювали з культурою ізольованих тканин і органів рослин, проводили експерименти чисто фізіологічного напрямку. У 1934 році один із засновників цього методу, П.Уайт, повідомив, що віруси відсутні у кінцівках коренів рослин, уражених вірусом тютюнової мозаїки. Подібні результати були отримані у 1949 році в дослідах П.Лімансе і М.Корнюа. Відсутність вірусів в апексах розміром не більше 0,1 мм складає основу методу одержання оздоровлених (безвірусних) рослин з меристем ін вітро, який запропонували Ж.Морель і К.Мартен. У 1952 році вони одержали безвірусні жоржини від уражених рослин.

Чому віруси відсутні у верхівочних меристемах?

Відповідь треба шукати при вивченні природи міграції і розмноження вірусів у рослині, а також в анатомо-фізіологічних особливостях верхівкових меристем.

Найбільш сприятливими органами для репродукції вірусів є тканини листків. У вірусів відсутні будь-які спеціальні пристосування для самостійного (автономного) пересування по рослині, тому можна передбачити симпластичний або апопластичний шлях їх міграції по сформованих тканинах і органах. Відомо, що обмін речовин і органічний зв’язок між клітинами здійснюється крізь пори, які вкриті потоншеною частиною первинної оболонки і мають власні дуже маленькі отвори, через які проходять тяжі цитоплазми – плазмодесми. Завдяки плазмодесмам з’єднуються в єдине ціле цитоплазми усіх живих клітин і утворюється так званий симпласт. Експерименти вказують на поширення фітовірусів від однієї клітини до іншої через плазмодесми і на залежність цього процесу від температури і метаболічної активності.

Мікроскопічні дослідження свідчать, що клітини верхівкової меристеми у період активного поділу дрібні, з тонкою целюлозною оболонкою ізодіаметричної форми. Вони щільно зімкнені між собою, не мають міжклітинників.

Отже, існують такі спостереження:

- віруси повільно розповсюджуються по рослині;

- клітини меристем швидко діляться;

- серед клітин верхівкових меристем відсутні міжклітинники, недостатньо налагоджена система плазмодесм, що ускладнює апопластичний і сим пластичний шляхи переміщення вірусу.

Таким чином, є всі підстави зробити припущення, що анатомо-фізіологічні верхівкових меристематичних клітин роблять неможливим надходження до них вірусів. Вірус не встигає за швидким утворенням перших груп меристематичних клітин у верхівці розміром 0,075-0,1 мм. Розмір меристем визначає поріг концентрації вірусних частинок.

Не виключені фізіологічно-генетичні механізми відсутності вірусів у меристематичних клітинах (наприклад, фітогормональне гальмування само реплікації вірусного геному).

Як правило, для ефективного звільнення від вірусів використовують шматочки меристем розміром 0,10-0,15 мм. Проте, чим менша за розмірами меристема, тим складніше вона приживається на поживному середовищі і регенерується у цілу рослину. Метод мікроклонального оздоровлення стає більш надійним і ефективним при додатковій термообробці і хіміотерапії рослин, про що йтиме мова нижче.

4.2.1. Поєднання методу верхівкових меристем із термотерапією

Окремі фізичні і хімічні фактори мають стимулюючу або пригнічуючи дія на віруси, а також на рослини, у яких вони репродукуються. До цих факторів належать температура, різні види випромінювання, постійне магнітне поле, рН середовища, деякі хімічні речовини.

Термотерапія рослин – один із ефективних методів профілактики і лікування вірусних захворювань. Піонером застосування термотерапії для лікування рослин вважають П.Кобуса, який у 1889 році використав гарячу воду проти вірусного захворювання цукрової тростини. Новий етап у розвитку термотерапії почався у 1935 році, коли американець Л.Кункель застосував гаряче повітря для лікування персика від жовтухи, дрібноплодності і розеточності.

Різні методики оздоровлення рослин від вірусів методом термотерапії передбачають інактивацію вірусної інфекції температурами 30-50^оС, які протягом певного періоду експозиції не завдають шкоди фізіології самої рослини. Наприклад, витримування насіння соняшника, пшениці і деяких видів рослин при температурах 45-50^оС протягом однієї години пригнічує вірусні інфекції і не порушує ріст зародка. Цей метод дозволяє брати для оздоровлення більші за розміром меристеми, які набагато краще виживають на поживних середовищах ін вітро (0,3-0,8 мм).

Метод термотерапії меристем має свої особливості: якщо в умовах високих природних температур (30-50^оС) вірус не ін активується повністю, то можливо одержати безвірусний матеріал з тих органів, які утворилися при цій температурі. Застосування методу особливо ефективне при отриманні безвірусних рослин, які розмножуються вегетативно (плодові, декоративні та квіткові рослини).

Спільною співпрацею вчених Росії, України і Бєларусі розроблені основні елементи технології безвірусного садивного матеріалу, яка складається з таких етапів (на прикладі картоплі):

1. Термічна обробка матеріалу (бульб або укорінених верхівок).

2. Виділення верхівкових меристем і регенерація з них рослин.

3. Індукція столоно- і бульбоутворення. Одержання мікро бульб картоплі ін вітро.

Для термотерапії відбирають вільні від зовнішніх інфекцій бульби, які ретельно миють. Бульби прогрівають у стерильному піску в спеціальних приміщеннях без освітлення, з вологістю повітря 75% і при температурі 37-38^оС протягом 6-12 тижнів. Для різних сортів режими прогрівання можуть відрізнятися. Наприклад, для стійких до підвищених температур сортів картоплі бульби прогрівають при 40^оС по 2-3 години на добу протягом 8 тижнів (решта доби – при 16-20^оС). Меристеми розміром 0,2-0,35 мм виділяють під бінокулярним мікроскопом з етіолованих паростків (схема).

Для термообробки можна використовувати також укорінені верхівки, які зрізають з рослин картоплі і занурюють у розчин гетероауксину (50 мг/л). Термообробку проводять у спеціальних камерах або кімнатах при освітленні; температура повітря 35-37^оС, ґрунту – близько 30^оС; довжина світлового періоду – 16 год. Рослини поливають водою, яку нагрівають до 30^оС. У таких умовах рослини вирощують протягом 4-6 тижнів, після того з них виділяють пазухові бруньки і проводять всі етапи мікроклонального розмноження (лекція 3). Термообробку краще проводити восени або взимку, щоб встигнути закінчити її до початку вегетації.

Одержані рослини мікро живцюють і використовують для індукції столоно- і бульбоутворення ін вітро. Процедура передбачає посадку мікроживців з невеликими листочками на модифіковане середовище Мурасіге-Скуга (підвищена концентрація сахарози 4-10%). Ріст рослини відбувається протягом трьох тижнів при 9-10-годинному фотоперіоді для ранніх сортів картоплі і 6-8-годинному – для пізніх сортів. Після цього рослини на два тижні переводять на 16-годинний фотоперіод і висаджують у теплицю.

Застосування цього методу дозволяє за 3-4 місяці одержати 2-3 тис. рослин, придатних для висадки в ґрунт, тобто близько 20 тис. мікро бульб за 9-10 місяців з однієї рослини. Це має велике значення для елітного насінництва.

Після досягнення мікро бульбами розмірів 0,7-1,8 см і відмирання рослин їх витягають із пробірок, відмивають від агару дистильованою водою і зберігають в колбах в холодильнику при 2-4^оС. Перед садінням мікро бульби прогрівають на сонці близько двох тижнів при температурі 15-20^оС.

Тривалість термічного впливу можна скоротити, використовуючи обробку садивного матеріалу гамма-променями та постійним магнітним полем. При цьому вдається зменшити експозицію термообробки в камерах, що так важливо при виконанні практичної роботи.

4.2.2. Хіміотерапія при оздоровленні рослин від вірусів

Метод хіміотерапії базується на обробці рослин речовинами-інгібіторами вірусів або на їх додаванні до поживного середовища ін вітро. Застосування захисних речовин стосовно збудника вірусних інфекцій ускладнюється тим, що переважна кількість хімічних препаратів фітотоксична, а решта не задовольняє вимоги контролю за якістю харчових продуктів і медикаментів.

Вчені вишукують антивірусні препарати, які виробляються самими рослинами. Позитивні результати отримані в цьому напрямку при використанні екстрактів лаванди, ромашки лікарської, шавлії та інших рослин.

Відома антивірусна дія антибіотиків. Наприклад, іманін – антибіотик, вилучений із звіробою, сприяє підвищенню стійкості томатів до деяких вірусних захворювань. Комплексне передсадивне застосування тіосечовини і гіберелінів для обробки бульб картоплі сприяє зниженню продукції X- та Y-вірусів у рослин.

Велике значення має рН середовище при само реплікації вірусу. У дослідах на картоплі встановлено, що при значеннях рН близько 10 відбувається дезагрегація вірусів і втрата їх активності. Використовують ацетилсаліциінтерферон, а також лізати вірусів (їх одержують шляхом кислотного або ферментного гідролізу вірусних препаратів).

Метод верхівкових меристем і хіміотерапія успішно доповнюють один одного при використанні панкреатичної РНК-ази, яку додають до поживного середовища. Відсоток здорових рослин-регенерантів на середовищі з РНК-азою у 1,5-2 рази вищий, ніж без неї. Відмічено пригнічення вірусної інфекції картоплі під впливом аналогів основ нуклеїнових кислот. Щоб збільшити частку безвірусних меристемних рослин, до поживного середовища часто додають препарат «Вірозол» (синтетичний рибоварин).

Вивчення питань хіміотерапії вірусних захворювань рослин знаходиться на сьогоднішній день у стані активного пошуку.

Існують інші методи одержання безвірусного рослинного матеріалу. Наприклад, метод мікрощеплення, який застосовують при умові, що насіння цитрусових, персика і багатьох плодових культур не передає віруси і залишається здоровим. Рослини, які виросли у пробірці ін вітро з насіння, готують під бінокулярною лупою для мікро щеплення – рослину зрізують, а на кінці залишка стебла роблять надріз, із яким зщеплюють необхідний меристематичний експлант.

Дата добавления: 2014-01-07