Діагностика рослин на наявність вірусів

Найважливіша перевага мікророзмноження – одержання величезної кількості рослин – може перетворитися у дуже небезпечний недолік, якщо матеріал не буде перевірений на чистосортність і відсутність вірусів. Особливо велике економічне значення при масовому виробництві садивного матеріалу має діагностика вірусів на всіх етапах оздоровлення.

Ідентифікація за морфологічними ознаками зустрічає ряд труднощів, бо зовнішні ознаки вірусних захворювань іноді бувають схожі з неінфекційними фізіологічними аномаліями у рослин, що виникають внаслідок незбалансованого живлення або надмірної кількості мінеральних добрив тощо. Крім того, вірус може знаходитися в рослині в прихованому (латентному) стані і зовнішні ознаки не виявляються.

Фізичні і біологічні особливості вірусів потребують специфічних методів їх діагностики. Сучасний стан досліджень передбачає використання таких методів діагностики на наявність вірусів:

- метод електронної мікроскопії;

- індикаторний (біологічний) метод;

- метод імунодіагностики (імуноферментний аналіз).

4.3.1. Діагностика вірусів за допомогою електронної мікроскопії

Форма і величина вірусів – надійний критерій їх ідентифікації за допомогою електронної мікроскопії. Електронний мікроскоп, що збільшує об’єкт у десятки тисяч разів, дозволяє побачити віруси, розміри яких коливаються в межах 20-450 нм (1 нм = 10^-9 м). Існують такі методи електронного мікроскопіювання:

- негативного контрастування;

- занурення;

- імуносорбентної електронної мікроскопії;

- інфрачервоної електроскопії;

- люмінесцентного аналізу.

Метод негативного контрастування. Листок рослини мацерують (подрібнюють) на склі в краплі контрастера (розчин фосфорно-вольфрамової кислоти – ФВК, рН 7,4 або 2% розчин уранілацетату, рН 7,4), а потім цю краплю наносять на сітку-підкладку, на якій витримують 2-3 хв. і відтягують фільтрувальним папером. Препарати висушують на повітрі і розглядають в електронному мікроскопі.

Метод занурення використовують для виявлення паличко- і ниткоподібних вірусів. Листок зрізують і місце зрізу на 1-2 сек. Занурюють у краплю дистильованої води, яку попередньо наносять на сітку-підкладку. Після висихання краплі препарат контрастують розчином ФВК або уранілацетату при експозиції 5-10 хв.

Метод імуносорбентної електронної мікроскопії дає можливість збільшити концентрацію вірусів на сітці-підкладці і підвищити достовірність аналізу. Сітки з гідрофільною плівкою (розведення антисироватки 1:10 або 1:100 в 0,1 М буферному розчині, рН 7) інкубують у вологій камері протягом 5-10 хв. при кімнатній температурі. При цьому білки антитіл сироватки сорбуються речовиною плівки-підкладки. Протеїни сироватки, що не адсорбувалися, видаляють промиванням сіток краплями буферу (трис-буфер 0,05 М, рН 7,2). Після цього на сітки-підкладки наносять краплю соку хворої рослини, інкубують протягом 10-20 хв., а потім промивають 2-3 рази 0,4 М розчином сахарози і дистильованої води для видалення решток клітин. Сітки висушують на повітрі. Вірусні частки контрастують протягом 2-5 хв. водним розчином уранілацетату в концентрації 2%, потім розглядають в електронному мікроскопі. Якщо спостерігаються змішані інфекції, аналіз повторюють, чергуючи діагностичні сироватки.

Метод інфрачервоної електроскопії. В його основі лежать біохімічні зміни, які відбуваються в клітинах і тканинах під дією вірусної інфекції, що проявляється в трансформаціях спектру інфрачервоної зони поглинання, яка відображає атомно-молекулярну структуру об’єкту. При цьому порівнюють спектри інфрачервоного поглинання хворих і здорових листків рослини.

Листок рослини закріплюють стандартним закріплювачем твердих зразків, що є в комплекті кожного інфрачервоного спектрометра. Після цього проводять реєстрацію (запис) спектру інфрачервоного поглинання зразка в спектральній області (у межах 850-1750 см^-1), яка є відповідною поглинанню білків і нуклеїнових кислот, що індукуються вірусною інфекцією. Зареєстрований при цьому спектр порівнюють із спектром інфрачервоного поглинання листка здорової рослини (стандарт). Про наявність або відсутність вірусної інфекції свідчать подібність або розбіжність характеристик спектрів інфрачервоного поглинання дослідного і стандартного зразка у даній області.

Метод люмінесцентного аналізу ґрунтується на явищі первинного і вторинного світіння уражених вірусами тканин рослин в ультрафіолетовому світлі, джерелом якого може бути освітлювач 01-18 із світлофільтром УФС-3.

Люмінесцентний метод можна застосовувати як допоміжний метод встановлення вірусної природи некрозу при локальній реакції на вірус, особливо якщо ці некрози дуже малі або на листках багато механічних пошкоджень.

4.3.2. Біологічний метод діагностики

Біологічний метод діагностики вірусів базується на використанні рослин-індикаторів. Це рослини, які чітко і специфічно реагують на ураження вірусом. Індикаторних рослин багато, інколи по декілька для одного і того ж вірусу. Найбільш ефективні рослини-індикатори: лобода гігантська (Chenopodium amaranticolor), лобода рисова (Chenopodium guinoa), тютюн турецький (Nicotinia tabacum), квасоля звичайна (Phaseolus vulgaris), шпинат новозеландський (Gompherena globosa), дурман (Datura strenonium) та ін. Лобода рисова відіграє у фітовірусологів роль не меншу, ніж кишкова паличка E. coli при вивченні бактеріофагів, а мавпа – в онкологічних захворюваннях. Ця рослина чутлива до 36 видів вірусів. Навіть вірус жовтухи (гепатиту) людини може уразити лободу з утворенням некрозів на її листках. Це може бути своєрідною діагностикою захворювання.

Рослини-індикатори вирощують ізольовано, в теплицях на стерильному ґрунті. Їх спочатку висівають у горщечки, які попередньо знезаражують 5% марганцевокислим калієм. Встановлено, що рослини-індикатори чутливіші при температурі 20-25^оС і освітленості 8-10 тис. люкс. Такі рослини стають ще чутливішими, якщо їх витримати перед цим 36-48 год. у темряві.

Для зараження слід використовувати молоді рослини (фаза 1-2 листка). Рослини-індикатори (6 і більше) заражують механічно – шляхом натирання їх листків соком дослідних рослин за допомогою шпателя. У плодових тест на наявність вірусів проводять на індикаторних рослинах шляхом подвійної окуліровки очками, у ягідних (суниця, малина, смородина) – методом щеплення зближенням або черешком листка.

Щоб зберегти інфекційність екстрактів, одержаних з хворої рослини, застосовують буферні розчини. Мацерацію тканини проводять у попередньо знезараженій ступці або гомогенізаторі. Як правило, рекомендується використовувати фосфатний буфер від 0,1 до 0,01 М, рН 6,5-7,0, тому що більшість вірусів ін активується при низькому значенні рН. При цьому до гомогенату рекомендується додавати активоване вугілля.

Після проведення інокуляції (через кілька хвилин) інокулюм з поверхні листків змивають водою, а рослини ставлять у затемнене місце на 12-24 год., щоб вони могли краще перенести зараження. Для більш швидкого одержання результатів потрібно застосовувати такі рослини-індикатори, які дають місцеву (локальну) реакцію. Якщо ж рослина-індикатор з місцевою реакцією невідома для конкретного передбачуваного вірусу, використовують рослини-індикатори з системною реакцією, на яких симптоми розвиваються на 7-10 день після зараження.

Спостереження за рослинами-індикаторами треба починати через 2 дні після зараження і проводити протягом 4 тижнів і більше. Ознаки локальної реакції проявляються, як правило, через 3-14 днів після інокуляції, системної – на 7-30 день.

Наприклад, при вивченні ультраструктурних змін у клітинах рослин огірків, інфікованих вірусом хлоротичної кільцевої плямистості, виявлена локалізація в цитоплазмі хаотично розташованих вірусоподібних частинок, які відрізняються від рибосом дещо більшими розмірами і більш крислатими обрисами. Інколи вірусоподібні частинки займають цитоплазматичний простір, відмічено їх зв’язок із цитоплазматичними мембранами. Під впливом вірусної інфекції порушується ультраструктура хлоропластів, відбувається їх вакуолізація.

4.3.3. Методи імунодіагностики

Основою імунодіагностичних методів є виявлення комплексу антиген-антитіло. Серед цих методів можна назвати реакцію преципітації в агаровому гелі, кальцепреципітацію, подвійну імунодифузію в агарі, латекс-тест та ін. Найбільш продуктивним і специфічним вважають твердофазний імуноферментний аналіз (ІФА), чутливість якого складає 4-15 нг/мл вірусу. Його можна застосовувати для ранньої діагностики вірусів як у рослинах, так і в посівному матеріалі.

Високо специфічні антитіла для проведення аналізу стандартні і входять до складу наборів. Їх окремо готують спеціалісти-імунологи за допомогою лабораторних тварин (кролі, морські свинки). При введенні в кров частково очищеного рослинного вірусу у відповідь організм тварин виробляє антитіла, суворо специфічні саме для цього вірусу. До цих антитіл «пришивають» фермент пероксидазу, тобто мітять антитіла. Пероксидаза зручна тим, що утворює із субстратом чітке кольорове забарвлення, яке визначається інструментально або візуально.

Для аналізу використовують сік з листків, бічних корінців, паростків, бульб рослин. Якщо вірус, що тестується (антиген), присутній в рослині, то він взаємодіє з міченими антитілами. Утворюється забарвлений комплекс антиген-антитіло-субстрат, оптична густина якого пропорційна концентрації вірусу.

Цей метод діагностики має назву ELISA-тест – ферментативне визначення за допомогою імуносорбентів.

Практика свідчить, що додатково необхідні також експрес-методи перевірки рослин на бактеріози та деякі хронічні грибні інфекції (трахеомікози).

Увесь комплекс діагностичних досліджень проводять тоді, коли мають справу з новою, мало вивченою хворобою, яка підозрюється як вірусна. Якщо ж вона добре вивчена, описана в літературі, то для встановлення вірусної природи проводять лише найнеобхідніші дослідження.

Дата добавления: 2014-01-07