СЛАЙД 6. Процесс изготовления гистопрепарата для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация

Процесс изготовления гистопрепарата для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация, 2) уплотнение материала, 3) приготовление срезов, 4) окрашивание или контрастирование цвета. Для световой микроскопии необходим ещё один этап - заключение срезов в бальзам или другие прозрачные среды (5).

Взятие материала (кусочка ткани или органа) для приготовления препарата. При этом учитываются следующие моменты:

забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, а при возможности от живого объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или органа;

забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани;

толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор мог проникнуть в толщу кусочка;

обязательно производится маркировка кусочка (указывается наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора и так далее).

Фиксация материала необходима для остановки обменных процессов и сохранения структур от распада. Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие жидкости, которые могут быть простыми спирты и формалин и сложными раствор Карнуа, фиксатор Цинкера и другие. Фиксатор вызывает денатурацию белка и тем самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их прижизненном состоянии. Фиксация может достигаться также замораживанием (охлаждением в струе СО2, жидким азотом и другие). Продолжительность фиксации подбирается опытным путем для каждой ткани или органа.

Заливка кусочков в уплотняющие среды (парафин, целлоидин, смолы) или замораживание для последующего изготовления тонких срезов.

Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме или ультрамикротоме) с помощью специальных ножей. Срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной микроскопии - монтируются на специальные сеточки.

Окраска срезов или их контрастирование (для электронной микроскопии). Перед окраской срезов удаляется уплотняющая среда (депарафинизация). Окраской достигается контрастность изучаемых структур. Красители подразделяются на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко используются основные красители (обычно гематоксилин) и кислые (эозин). Нередко используют сложные красители.

Просветление срезов (в ксилоле, толуоле), заключение в смолы (бальзам, полистерол), закрытие покровным стеклом.

После этих последовательно проведенных процедур препарат может изучаться под световым микроскопом.

Для целей электронной микроскопии в этапах приготовления препаратов имеются некоторые особенности, но общие принципы те же. Главное отличие заключается в том, что гистологический препарат для световой микроскопии может длительно храниться и многократно использоваться. Срезы для электронной микроскопии используются однократно. При этом вначале интересующие объекты препарата фотографируются, а изучение структур производится уже на электронограммах.

СЛАЙД 7

СЛАЙД 8

методы визуализации:

общегистологические (обзорные)

специальные (для выявления отдельных структур)-гистохимические, иммуногистохимические, цитогенетические

электронная микроскопия – изучение ультраструктур

СЛАЙД 9

общигистологические основаны на различном химическом составе клеточных структур – в ядре – ДНК, в ядрышке – РНК, в цитоплазме – белки органелл + различные по составу включения. Они по-разному воспринимают красители.

СЛАЙД 10

Кислые – эозин, фуксин – красят цитоплазму, окрашенные ими структуры – окси фильные (эозинофильные /фуксинофильные). Гематоксилин – основной краситель – базофильные структуры (ядро).

СЛАЙД 11

СЛАЙД 12

А. Световая микроскопия - исследования обычным световым мик-пом.

Б. Спец-ые методы микроскопирования:

- фазовоконтрастный микроскоп (для изуч. живых неокраш-х обьектов)

-темнопольный микроскоп (для изуч. живых неокраш-х обьектов)

-поляризационный мик-п(для иссл. обьектов с упорядочонным распола-

жением молекул - скелет. муск-ра, коллагеновые волокна и т.д.)

--люминесцентный мик-п (для изуч. живых неокраш-х обьектов)

В. Электронная микроскопия:

-трансмиционная (изучение обьектов на просвет)

-сканирующий (изучение поверхности обьектов)

Первая дает лишь плоскостное изображение, вторая - пространственное; главным достоинством последнего (растрового) является большая глубина резкости (в 100-1000 раз больше, чем у световых микроскопов), широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от десятков до десятков тысяч раз) и высокая разрешающая способность.

СЛАЙД 13

Дополнительные (специальные, гистохимические, иммуногистохимические, цитогенетические и др.) методы необходимы для:ƒ

Установления типа клеток, их тканевой принадлежности

ƒУстановления степени дифференцировки клеток

ƒУстановления активности деления клеток

ƒУстановления наличия мутаций генов

Определения других биологических свойств клеток (наличие

рецепторов, молекул клеточной адгезии, молекул дифференцировки идр.)

1. Гистохимические и цитохимические методы позволяет определять состав химических веществ и даже их количество в изучаемых структурах. Метод основан на проведении химических реакций с используемым реактивом и химическими веществами, находящимися в субстрате, с образованием продукта реакции (контрастного или флюоресцентного), который затем определяется при световой или люминесцентной микроскопии.

2. Иммуноморфологические методы позволяет с помощью предварительно проведенных иммунных реакций, на основании взаимодействия антиген-антитело, определять субпопуляции лимфоцитов, определять степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов (определять гистосовместимость) для трансплантации органов.

СЛАЙДЫ 14-20

3. Метод культуры клеток (in vitro, in vivo) выращивание клеток в пробирке или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.

4. Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов в изучаемые структуры. Метод используется чаще всего в экспериментах на животных.

5. Метод дифференциального центрифугирования позволяет изучать отдельные органеллы или даже фрагменты, выделенные из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2-х до 150 тыс.) и получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.

6. Метод интерферометрии позволяет определить сухую массу веществ в живых или фиксированных объектах.

Дата добавления: 2014-01-07