В КДЛ наиболее часто - колориметрические и спектрофотометрические методы

Методы определения активности ферментов

V Поддерживать оптимальный состав реакционной смеси (присутствие коферментов, ионов металлов и др.).

V При необходимости длительной инкубации к реакционной смеси добавить антисептики (толуол, хлороформ, тимол и др.), при этом добавляемые вещества не должны влиять на активность определяемого фермента.

V Буферный раствор должен поддерживать рН инкубационной смеси, близкой к оптимальному для данного фермента. Результаты определения активности фермента, полученные с помощью одного и того же метода, но с разными буферными растворами, хотя одного и того же рН, несравнимы.

Основные условия при определении активности ферментов

ОБЩИЕ ПРАВИЛА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Факторы, влияющие на скорость высвобождения ферментов из тканей

1. Концентрационный градиент (соотношение внутриклеточной к внеклеточной активности). Пример: в гепатоцитах содержание ЛДГ в 3000 раз выше, чем вне клеток → фермент быстрее уходит из клетки.

2. Размер ферментных молекул. Более мелкие молекулы высвобождаются на ранней стадии повреждения.

3. Внутриклеточная локализация ферментов. Наиболее легко высвобождаются ферменты цитозоля, из митохондрий намного медленнее (лишь при распаде внутриклеточных органелл).

Механизмы инактивации
и удаления энзимов

Плохо изучены.

1. Экскреция с мочой (амилаза), желчью. Противоречие: активность ферментов в сыворотке падает быстро, а число ферментов, выводимых путем экскреции ограничено ММ.

2. Первоначальная инактивация ферментов в плазме и катаболизм в клетках различных тканей

Период "полужизни" некоторых ферментов в плазме крови

Название фермента	Период "полужизни"
Аспартатаминотрансфераза	17 ± 5 ч.
Аланинаминотрансфераза	47 ± 10 ч.
Глутаматдегидрогеназа	18 ± 1 ч.
ЛДГ1	113 ±60 ч.
ЛДГ5	10 ±2 ч
Креатинкиназа	15 ч.
Щелочная фосфатаза	3 — 7 дней
γ-Глутамилтранспептидаза	3 — 4 дня
Холинэстераза	10 дней
Амилаза	3 — 6 ч.
Липаза	3 — 6ч

О количестве фермента можно судить только косвенно по его активности, т. е. по производимому ферментом действию. Присутствие и количество фермента распознается по специфичности и скорости катализируемой им реакции.

Методы определения активности фермента:

Ø по скорости накопления продуктов ферментативной реакции

Ø по скорости убыли субстрата

Рекомендуется активность ферментов определять по начальной скорости реакции, когда количество превращенного субстрата не превышает 20% от исходного.

v Температура в пределах 25—40°С, как правило 37°С.

Дата добавления: 2014-01-07