Тема: Получение биопрепаратов для защиты растений

Лекция № 13

Раздел: «Сельскохозяйственная биотехнология»

План:

1. Создание бактериальных препаратов для защиты растений. Работы по введению гена δ-эндотоксина в геном растений.

2. Технология получения грибных энтомопатогенных препаратов.

3. Технология получения вирусных энтомопатогенных препаратов.

4. Неспецифические методы защиты растений. Иммунизация растений.

Убытки сельского и лесного хозяйства от насекомых-вреди­телей ежегодно исчисляются в мире цифрой около 100 млрд. долл. Развившаяся устойчивость у насекомых-вредителей к ядохимика­там привела к необходимости поиска новых эффективных средств борьбы. Оказалось перспективным использование собственных природных патогенов — микроорганизмов, вызывающих гибель насекомых-вредителей в их природных условиях. В настоящее время в различных странах мира производят более 30 микро­биологических энтомопатогенных препаратов. Они характеризу­ются высокой специфичностью поражения определенных видов насекомых и практически полной безвредностью для человека, теплокровных животных, птиц и полезных насекомых.

Энтомопатогенные препараты, получаемые на основе микро­организмов, выделенных из естественных условий и внесенных вновь в те же естественные условия в виде микробных патогенов, не вызывают нежелательных изменений в биоценозах и не на­рушают экологического состояния в регионе. Это делает их более перспективными по сравнению с традиционно используемыми химическими инсектицидами.

Все микробные патогены выпускают в виде смачивающихся '"тюрошков или паст, реже дустов, гранул, инкапсулированных по­рошков, стабилизированной эмульсии спор и кристаллов. При не­посредственном применении различных форм препаратов предпо­лагается использование различных добавок в виде растворителей, прилипателей, эмульгаторов, способствующих повышению их эффективности.

1. Создание бактериальных препаратов для защиты растений. Работы по введению гена δ-эндотоксина в геном растений.

Среди всех промышленно выпускаемых микробных патогенов бактериальные препараты получили наибольшее распростране­ние. Их отличают высокая вирулентность по отношению к насеко­мому-вредителю, безопасность для окружающей флоры и фауны, достаточно высокая скорость воздействия на вредителя и т. д. В мировой практике используются бактериальные энтомопатогенные препараты для борьбы более чем со 160 видами вредных насекомых.

Из всех энтомопатогенных бактерий наиболее полно исследо­вана сеточки зрения применения грамположительная бактерия Bac. thuringiensis, которая помимо образования спор, вызываю­щих септицемию насекомого при попадании внутрь его тела, в ходе культивирования продуцирует ряд токсичных соединений, повышающих эффективность приготовленных на ее основе пре­паратов. Среди таких токсинов наиболее часто используется δ-эндотоксин. Чтобы насекомое погибло, его кристаллы должны попасть в его организм. После поглощения кристаллов гусеницы прекращают питаться. При некоторых индивидуальных различиях насекомых первичным местом действия δ-токсина всегда является средний отдел кишечника. В зависимости от реакции на кристаллы все насекомые делятся на три группы, для которых: 1) характерен общий паралич; 2) паралич среднего отдела кишечника; 3) на­секомые вообще не восприимчивы к кристаллам, а реагируют на весь препарат в целом. Большинство насекомых относится к этой третьей группе: они погибают не от эндотоксина, а в результате прорастания спор и последующего размножения бактерий, при­водящего к септицимии.

Способность Bac. thuringiensis образовывать различные ток­сические продукты, споры, кристаллы используется в промыш­ленности при производстве на основе этого микроорганизма широкого круга различных энтомопатогенных препаратов. Рас­смотрим некоторые из них. Энтобактерин на основе Bac. thuringiensis var. galleriae выпускается в виде порошка, жидкости в смеси с прилипателем и в виде пасты. Инсектин вырабатывается на основе спор и кристаллов Bac. thuringiensis var. insectus. Алестин получают из спор и кристаллов Bac. thuringiensis var. alesti в виде порошка или стабилизированной пасты. Экзотоксин содержит культуральную жидкость Bac. thuringiensis var. insectus, имеет вид порошка, содержащего 3,3% экзотоксина. Токсобактерин производится на основе спор, кристаллов и экзотоксина Bac. thuringiensis var insectus, выпускается в виде смачивающегося порошка в смеси с прилипателем, содержит в 1 г 30 млрд. спор и кристаллов и 0,025 г экзотоксина. Дендробациллин включает споры и кристаллы Bac. thuringiensis var. dendrolimus, употребляется в виде смачивающегося порошка, содержащего не менее 30 млрд. спор в 1 г. Битоксибациллин или БТБ-202 готовится на основе спор и метаболитов Bac. thuringiensis var. thuringiensis в виде порошка, содержащего в 1 г препарата 30 млрд. спор и кристаллов.

Промышленное производство энтомопатогенных бактерий. Оно предполагает глубинное культивирование с целью получе­ния максимального титра клеток в культуральной жидкости и накопления токсина

Все бактериальные энтомопатогенные препараты на основе Bac. thuringiensis производят по одной и той же технологической схеме. Ниже, в качестве иллюстрации, будет рассмотрена техно­логия получения энтомопатогенных бактериальных препаратов на примере энтобактерина. Технология производства включает все стадии, типичные для любого микробиологического производства, основанного на глубинном способе получения микроорганизмов:

выращивание посевного материала в лаборатории и в посевном аппарате, промышленное культивирование в ферментере, концен­трирование культуральной жидкости, сушка, стандартизация и фасовка готового препарата.

В условиях предприятия производственный Bac. thuringiensis var. galleriae предварительно пересевают на мясо-пептонный агар и проверяют его на отсутствие свободного фага, продуктивность и вирулентность. Посевной материал получают в виде стадии: сначала выращивают культуру в конических кол­бах на 3 л; полученным посевным материалом, имеющим титр не менее 1,7*10⁹ спор в 1 мл, в количестве 0,05% от объема среды засевают посевной аппарат и проводят культивирование при объемной аэрации 0,2 л воздуха на 1 л среды в 1 мин. По­севной материал с тем же титром спор в количестве 0,0012% от объема среды основного аппарата передают в ферментер. Температуру культивирования на всех стадиях выращивания поддерживают постоянной (28—30°С). Продолжительность фер­ментации в посевном аппарате и производственном ферментере составляет 35—40 ч. Остальные параметры производственной ферментации остаются теми же, что и при выращивании в по­севном аппарате.

Процесс культивирования заканчивают при степени споруляции культуры 90—95 % и титре спор не менее 10⁹ в 1 мл. Готовую культуральную жидкость перекачивают в отдельный простерилизованный сборник; подкисляют до рН 6,0—6,2 и пе­редают на стадию сепарации. В результате сепарации получают пасту влажностью 85 % с выходом около 100 кг в 1 м³ культуральной жидкости и титром порядка 20*10⁹ спор в 1 г. Ее соби­рают в отдельном сборнике, а фугат при необходимости можно еще один или два раза употребить для приготовления питатель­ной среды.

Подготовленную таким образом и отвечающую всем требова­ниям пасту направляют на получение готового препарата энтобактерина. Конечным продуктом производства может быть либо смачивающий порошок, либо стабилизированная паста. Первый получают путем предварительного увлажнения пасты с последую­щим высушиванием на распылительной сушилке до остаточной влажности 10% и смешением (стандартизацией) с каолином до титра 30*10⁹ спор в 1 г. Готовый препарат фасуют по 20 кг в 4-слойные крафт-мешки с полиэтиленовым вкладышем и марки­руют. Вторую — внесением в пасту карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ). При смешении молекулы КМЦ сорбируют белковые кристаллы и споры, заряжая их отрицательно, что способствует более равномерному распределению активного начала по всему объему пасты и позволяет консервантам с одинаковой плотно­стью распределиться между частицами. Последнее значительно увеличивает срок хранения препарата. Готовый продукт в этом варианте представляет собой вязкую жидкость кремового или светло-серого цвета, однородную по составу, не распыляющуюся и не замерзающую при хранении, без запаха, не подвергаю­щуюся гниению или брожению.

Препарат предназначен для борьбы с насекомыми-вредителя­ми садовых, огородных и парковых растений. Эффективен в борь­бе с более чем 60 видами насекомых. Применяют его путем опрыскивания растений в виде водной эмульсии в период актив­ного питания вредителя. При опрыскивании в неблагоприятных погодных условиях (дождь, низкая температура, повышенная солнечная радиация) концентрацию препарата удваивают. Чем выше температура в момент применения и в последующие двое суток, тем выше эффективность энтобактерина и тем скорее на­ступает гибель насекомых. Как правило, основная масса вреди­телей погибает в течение 2—10 дн. На опрыскивание 1 га овощ­ных культур расходуют 1—3 кг препарата, садовых—3—5 кг, прибавка урожая от применения энтобактерина соответственно достигает 50 и 5 ц с 1 га.

В биотехнологическом центре Монсанто проводятся генноинженерные работы по выяснению возможности расширения спектра насекомых поражаемых токсином Bac. thuringiensis, а также возможности введения этого токсина непосредственно в растения. Были получены трансгенные растения табака, способные синтезировать токсин этой бактерии в форме химерного белка. Конструкция содержала токсикогенную часть исходного гена, начиная с кодона 29 по 607, состыкованную по C концу с геном канамицинустойчивости. Такой белок обладал и полной токсикогенностью, и способностью придавать бактериальным растительным клеткам устойчивоть к канамицину, что успешно использовалось в процессе селекции нужных клонов. При этом транскрипция мРНК химерного токсина в 5 – 10 раз превышало экспрессию исходного токсинового гена в трансформированных клетках растений.

2. Технология получения грибных энтомопатогенных препаратов

Энтомопатогенные препараты на основе микроскопических грибов способны поражать большое количество насекомых-вре­дителей, вызывая у последних заболевание — микоз.

По сравнению с энтомопатогенными бактериями и вирусами грибы обладают рядом особенностей: а) поражение происходит не через пищеварительный тракт, а непосредственно через кути­кулу; б) насекомые поражаются в фазе развития куколки и имаго, что не наблюдается при взаимодействии с другими видами микроорганизмов; в) грибы характеризуются относительно боль­шой скоростью роста и огромной репродуктивной способностью, в виде спор могут длительное время находиться в природных ус­ловиях без заметного снижения энтомопатогенной активности; г) высокая специфичность в поражении отдельных видов насе­комых, причем вирулентность в значительной степени зависит от штамма используемого гриба.

Воздействие грибного препарата на насекомое начинается с проникновения споры в полость его тела через кожные по­кровы. Наиболее интенсивно такое проникновение осуществляет­ся через промежутки между сегментами.

Попав в тело насекомого, грибная спора прорастает в гифу, затем разрастается в мицелий, от которого отчленяются гифальные тельца — конидии, составляющие инфекционную единицу энтомопатогенных грибов. При благоприятных условиях образо­вание конидий происходит на поверхности кутикулы. Выросшие на кожном покрове конидии своими апрессориями (вздутиями на концах ростовых трубок) прикрепляются к кутикуле и пус­кают мицелиальные ростки в тело насекомого. Оказавшись в теле насекомого, конидии циркулируют в его гемолимфе, начинает­ся развитие гриба. Уже на этой стадии возможно его поражение вследствие выделения некоторыми штаммами значительного ко­личества токсинов. Как правило, летальный исход наблюдается вследствие нарушений циркуляции гемолимфы и от выделения грибом токсических веществ.

В отсутствие или недостатке токсина постепенно нитевидный мицелий заполняет все тело насекомого. Прежде всего гриб по­ражает мышечную ткань. Его рост продолжается до тех пор, пока все внутренние органы и ткани не будут разрушены. Впос­ледствии могут образовываться конидиеносцы, которые проры­вают кутикулу и полностью обволакивают мертвую личинку. Продолжительность периода от прорастания конидий до гибели для различных по своим размерам насекомых оценивается от 2 до 8 сут.

Перспектива применения грибных энтомопатогенов определя­ется в основном возможностями создания необходимой сырьевой базы для их промышленного производства (преимущественно способом глубинного культивирования) и разработкой техноло­гии получения посевного материала.

Основное внимание привлечено к организации промышленно­го производства препаратов на основе отдельных штаммов гри­бов из следующих родов: Beauveria (возбудитель белой мускардины), Metarrhizium (возбудитель зеленой мускардины) и Enthomophthora (поражающий сосущих насекомых).

Производство препаратов на основе гриба рода Beauveria основывается на промышленном культивировании таких его ви­дов, как B. bassiana vuill, поражающих 60 видов насекомых, B. tenella del, способного уничтожать до 10 видов насекомых, преимущественно жуков.

В СССР освоено промышленное получение грибного энтомо-патогенного препарата боверина, включающего конидиоспоры гифомицета B. bassiana (bals.) vuill. Готовый препарат вы­пускается в виде порошка белого или кремового цвета, содер­жащего в 1 г от 1,5 до 6 млрд. конидиоспор. Помимо спор актив­ным началом боверина считается продуцируемый грибом ток­син — боверицин. Для достижения показателя ЛК₁₀₀ (летальная концентрация, вызывающая 100%-ную гибель тест-насекомого) в качестве инсектицидной добавки употребляют севин, хлорофос, фозалон и другие в количестве 10% от принятой для данного региона нормы расхода. Это позволяет на 90 % сократить внесе­ние ядохимикатов в зону активного земледелия.

Препарат безвреден для теплокровных животных и человека, не вызывает ожогов у растений.

Технология получения боверина методом глубинного культи­вирования. Производство боверина методом глубинного культи­вирования осуществляют в строго асептических условиях. Одной из наиболее важных стадий его является выбор технологии по­лучения посевного материала.

Исходный штамм, хранящийся на косяках агаризованного пивного сусла или среде Сабуро, сначала размножают при тем­пературе 25—28°С в течение 3—4 сут культивированием в качалочных колбах на жидкой питательной среде. Полученные конидиоспоры лиофильно высушивают. Такой посевной материал может храниться на предприятии в течение. 1 года, сохраняя свою жизнеспособность и вирулентность.

Посевной материал для засева питательной среды ферментера получают в 1—2 стадии: путем размножения культуры сна­чала в колбах, потом в инокуляторе или сразу в инокуляторе. Для засева основного аппарата требуется посевной материал в количестве 2—10% от объема питательной среды.

На всех стадиях производственного культивирования исполь­зуется питательная среда одного и того же состава и поддержи­вается постоянной оптимальная для каждого штамма темпера­тура. В состав питательной среды обычно входят следующие компоненты (в %): дрожжи кормовые нелизированные—2; крахмал—1; хлорид натрия—0,2; хлорид марганца—0,01; хлорид кальция — 0,05.

Содержание последнего может сильно варьировать вплоть до 0,75—5 %, поскольку его значительная добавка обеспечивает большую устойчивость образующихся конидиоспор к различным неблагоприятным воздействиям. В част­ности, к температуре рН среды культивирования, как правило, специально не устанавливают, выращивание проводят при значе­нии рН, которое наблюдается после добавления всех компонентов питания (обычно оно находится в пределах от 4,5 до 5,6). Про­должительность культивирования спорового посевного материала составляет 25—28 ч при температуре 25—28°С, а длительность культивирования в основном ферментере при той же темпера­туре достигает 3—4 сут. Выращивание гриба в посевном аппа­рате (инокуляторе) и в производственном ферментере проводят в условиях постоянного перемешивания и принудительной аэра­ции, причем в зависимости от используемого штамма количество подаваемого воздуха значительно меняется, достигая 2,5 объемов на 1 объем среды в 1 мин.

Боверин применяют против листогрызущих вредителей сада, а также против яблонной и восточной плодожорки, вредителей леса. Наибольший эффект дает применение боверина против личинок колорадского жука на картофеле. С добавками химиче­ских инсектицидов применение препарата приводит к 100%-ной гибели личинок всех возрастов. Норма расхода боверина 1—2 кг на 1 га. Растения обрабатывают препаратом путем опрыскивания. Смешение с ядохимикатами осуществляют за 2 ч до применения.

3. Технология получения вирусных энтомопатогенных препаратов

Из всех энтомопатогенных препаратов вирусные обладают наиболее высокой специфичностью по отношению к насекомому-хозяину. Они поражают обычно не более одного вида. Их ярко выраженная видоспецифичность обусловливает практически пол­ную безвредность вирусных препаратов для человека, флоры и фауны. Вирусы отличает высокая устойчивость к неблагоприят­ным воздействиям окружающей среды (температуре, влаж­ности), они способны сохранять свою активность в течение 10— 15 лет, находясь вне насекомого.

Заражение насекомого вирусом происходит при питании вредителя. Попавшие в кишечник тельца-включения при щелоч­ных значениях рН разрушаются. Освобожденные вирионы про­никают через стенку кишечника в восприимчивые клетки, в ядрах которых осуществляется репликация вирусов. Высвободившиеся вирусы заражают другие клетки, что в итоге приводит к гибели личинок насекомого.

Отличительной особенностью вирусов является то, что они могут размножаться только в живой ткани. Это создает опреде­ленные трудности в организации промышленного производства таких энтомопатогенов, так как технология размножения вирусов должна быть связана с использованием живых насекомых-хо­зяев. Последнее представляет собой достаточно трудоемкий про­цесс.

В СССР осуществляется выпуск трех вирусных энтомопатогенных препаратов: вирин-ЭКС (против капустной совки), ЭНШ (против непарного шелкопряда) и АББ (против американской белой бабочки).

Производство любого из вирусных препаратов начинают с разведения насекомого-хозяина на искусственных питательных средах, обеспечивающих их физиологически здоровое состояние. На определенной стадии развития (обычно на стадии гусеницы) насекомых заражают, добавляя вирусную суспензию к корму. При этом инокулят предварительно получают от нескольких больных личинок.

После заражения насекомых выдерживают в строго опреде­ленных условиях, обеспечивающих максимальное накопление вируса в его тканях. Через 7—9 сут собирают мертвые и отмира­ющие личинки, подсушивают их при 33—35°С, измельчают меха­ническим способом для вывода телец-включений из тканей. К полученной массе добавляют физиологический раствор или дистиллированную воду из расчета 1 мл на гусеницу, взвесь измельченных тканей фильтруют.

При производстве препарата вирин-ЭКС полиэдры осаждают из фильтрата центрифугированием. Осадок суспендируют в минимальном количестве дистиллированной воды и добавляют предварительно простерилизованный глицерин до титра 1 млрд. полиэдров в 1 мл. Готовый препарат разливают во флаконы в количестве, соответствующем одной или нескольким гектарным нормам.

Данная технология позволяет увеличить количество полиэд­ров в 5—10 тыс. раз по сравнению с расходом инокулята. С одной гусеницы в среднем удается получить до 36 млрд. полиэдров, что составляет около 30% ее сухой массы.

При производстве препарата вирин-ЭНШ в фильтрат добав­ляют лактозу, а после перемешивания ацетон в соотноше­нии 4:1 к объему суспензии. После отстаивания надосадочную жидкость сливают, а осадок подсушивают до полного удаления ацетона. При изготовлении готовой формы препарата в виде дуста сухой осадок смешивают с мелкодисперсным наполнителем — каолином или бентонитом — до получения титра 1 млрд. полиэдров в 1 г. Масляную форму препарата готовят путем. диспергирования осадка в предварительно простерилизованном 50%-ном растворе глицерина до титра 2 млрд. полиэдров в 1 мл, потом стерильно добавляют равный объем солярового масла, перемешивают и разливают во флаконы.

Вирусные энтомопатогенные препараты применяют путем вне­сения полиэдров в плотные популяции насекомых с целью воз­никновения в этой популяции эпизоотии. Эффект от применения препарата может быть значительным, если энтомопатогенный вирус отсутствует в популяции. Данный способ обработки пред­полагает внесение небольших количеств препарата.

В другом случае путем опрыскивания или опыления про­водится массированная обработка растений на зараженных уча­стках в период рождения личинок или на ранних стадиях их развития. Эффект достигается после внесения значительных количеств препарата в результате однократной или повторной обработки защищаемых растений.

Если требуется защита не от одного, а от нескольких вреди­телей, то действие вирусных энтомопатогенных препаратов соче­тают с другими средствами борьбы.

4. Неспецифические методы защиты растений. Иммунизация растений.

В фитовирусологии известен феномен перекрестной индуцированной устойчивости растений к вирусным инфекциям. Так, растения табака, зараженные одним штаммом вируса табачной мозаики устойчивы к заражению другими штаммами. Перекрестная устойчивость у растений развивается после определенного периода, следующего за введением ослабленного или инактивированного штамма (вакцины) и длить 4-6 недель. У иммунизированных растений при последующем инфицировании вирусом дикого типа инфекция не развивается, возникает лишь локальное поражение некоторых клеток. Возникающий иммунитет носит неспецифический характер. Его механизм включает 2 составляющие:

1. Пассивный компонент – происходит интерференция между вирусом-индуктором и суперинфецирующим вирусом.

2. Активный компонент – защитный эффект связан с индуцированием капсидом вируса интерефероноподобных белковых веществ в растении, которые либо захватывают РНК суперинфецирующего штамма, либо не дают этому штамму «раздеваться».

Индуцированная перекрестная устойчивость растений к фитовирусным инфекциям широко используется на практике для защиты ряда сельскохозяйственных культур – томатов, табака, картофеля и плодовых. Чаще всего в качестве индуктора для иммунизации используют мало патогенные или не патогенные штаммы фитовирусов. Также практическое использование феноменов индуцированной перекрестной устойчивости в интересах защиты растений от вирусных инфекций связаны с получением генноинженерных конструкций на основе плазмид агробактерий, вируса мозаики цветной капусты, в которые встраивают ген белка того фитовируса, против которого планируется получить иммунитет.

Дата добавления: 2014-01-07