Лекция № 9-10

І. Тема: Моделирование биотехнологических процессов.

Питательные (культуральные) среды и критерии качества исходного сырья. Процессы биосинтеза с дробным добавлением питательных субстратов. Понятие о мутагенезе, гибридизации и гибридной технологии.

ІІ. Цель: Ознакомить студентов с основами моделирования биотехнологических процессов, с требованиями к качеству исходного сырья, с процессами биосинтеза с дробным добавлением питательных субстратов, с понятием о мутагенезе и видами мутаций.

ІІІ. Тезисы лекции:

Важнейшим фактором эффективности технологии ферментных препаратов является качество питательной среды. Основное требование к качеству питательной среды состоит в полноценности ее состава, обеспечивающий рост продуцента и биосинтез целевого фермента. Микроорганизмы нуждаются прежде всего в соединениях, содержащих углерод, азот, водород и кислород. К ним относятся органические вещества, соли аммония и вода. Кроме того в состав питательной среды должны быть включены минеральные соединения, содержащие Mg, Ca, P, S, Fe, K и другие макро- и микроэлементы, витамины, ростовые вещества (биотин, инозит) и пр. Питательные среды в зависимости от состава делятся на синтетические и комплексные. Синтетическими считают те среды, которые состоят из определенного по качественному и количественному составу набора индивидуальных веществ. В комплексные среды входят различные природные продукты, часто отходы пищевых производств. К их числу относятся различные жмыхи, барда спиртовых заводов, картофельная мезга, кукурузный экстракт, меласса, отруби и прочие продукты. Благодаря использованию отходов комплексные питательные среды доступны, дешевы и обеспечивают безотходность биотехнологических производств.

Микроорганизмы в природе не синтезируют целевые вещества с заданными свойствами в масштабах, когда их выделение стало бы рентабельным. Очевидным является необходимость осуществления физиологических подходов к направленному биосинтезу целевых продуктов – получение микроорганизмов-продуцентов. Таким образом, становится актуальным освоение студентами теоретических основ и методов расширения номенклатуры промышленных штаммов-продуцентов.

Как правило, в промышленной биотехнологии не используют дикие микроорганизмы, а получают штаммы. Штаммами (Stаmmеn - нем., происходить) называются чистые культуры микроорганизмов, выращенных в определенных условиях и способных к синтезу определенного комплекса веществ (липидов, витаминов, аминокислот и др.) для поддержания их жизнедеятельности, размножении и распространения. Штамм считается низшей таксономической единицей бактерий.

Специфические и особенности микроорганизмов определили набор тех признаков и свойств, которые используются для их систематизации, классификации и идентификации.

1. Морфологические признаки – величина, форма, характер взаиморасположения.

2. Тинкториальные свойства – способность окрашиваться различными красителями. особенно важным признаком является отношение к окраске по Грамму, которое зависит от структуры и химического состава клеточной стенки бактерий. Морфологические свойства и отношение к окраске по Грамму определяют принадлежность к крупным таксонам - роду, семейству и т.п.

3. Культуральные свойства – особенности роста бактерий на жидких (образование пленки, осадок, помутнение) и плотных (форма, размер, консистенция, края, поверхность, прозрачность колоний, образование пигмента и другие свойства) питательных средах.

4. Спорообразование – форма и характер расположения споры в клетке.

5. Физиологические свойства – способы углеродного (аутотрофы, гетеротрофы), азотного (аминотрофы, аминогетеротрофы) питания; тип дыхания (аэробы, факультативные анаэробы, строгие анаэробы, микроаэрофилы).

6. Биохимические свойства – способность ферментировать различные углеводы, протеолитическая активность, образование индола, НS₂, наличие уреазы и других ферментов и т.д.

7. Химический состав клеточных стенок – содержание и состав основных сахаров и аминокислот.

8. Липидный и жирнокислотный состав – изучение состава жирных кислот проводят с помощью газовой хроматографии, которая обладает высокой разделительной способностью и чувствительностью.

Под колонией принято понимать видимую простым глазом изолированную структуру, образующуюся в результате размножения и накопления бактерий за определенный срок инкубации. Колония образуется обычно из одной родительской клетки или из нескольких идентичных клеток. Поэтому пересевом изолированной колонии может быть получена чистая культура микроорганизма.

Под культурой понимают всю совокупность бактерий, выросших на плотной или жидкой питательной среде. Как колония, так и чистая культура каждого вида характеризуется определенными признаками.

Основной и главный принцип бактериологии – во избежание ошибок изучать свойства только чистых, однородных культур.

Каждая выделенная культура данного вида бактерий называется также штаммом, то есть конкретным образцом данного вида.

Наиболее широко используемым методом выделения чистой культуры является метод Дригальского, который состоит в следующем: на поверхность чашки Петри с мясо-пептонным агаром (или какой-либо другой питательной средой) наносят петлей или пастеровской пипеткой небольшую каплю исследуемого материала. Стерильным шпателем каплю тщательно растирают по всей поверхности питательной среды, после чего тем же шпателем (не беря нового материала) делают посев еще на двух чашках. В результате такого посева на поверхности третьей чашки, а иногда и на второй вырастают отдельные колонии, которые после макро- и микроскопического изучения пересевают в пробирки с питательной средой.

Для получения более совершенных штаммов, синтезирующих заданный (целевой) продукт в больших, чем обычно, количествах, требуется правильный подбор условий их культивирования.

Основным методом расширения номенклатуры промышленных штаммов до сих пор остается индуцированный мутагенез и ступенчатый отбор. В этом случае популяцию клеток обрабатывают мутагеном (чаще всего специальным химическим веществом или УФ-светом), рассеивают на питательную среду и анализируют популяции, возникшие при размножении отдельных клеток (клональный анализ). Отобрав более продуктивный клон, процедуру повторяют (ступенчатый отбор). Метод чрезвычайно трудоемок. Обычная бактериальная клетка содержит около 5000 генов. Мутагенез неограничен, то есть нельзя предсказать заранее, у какого гена произойдет мутация, поэтому большинство мутаций вредно или летально для клеток, следовательно, нужная мутация (или набор мутаций) возникает редко. Таким образом, основной недостаток метода – непредсказуемость результатов плюс трудоемкость.

При этом (кроме того) ферменты, участвующие в биосинтезе (или в метаболизме) конкретных продуктов, осуществляют их количественный контроль, то есть при повышении внутриклеточной концентрации того или иного вещества его синтез под действием соответствующего фермента снижается или подавляется.

Мутационным путем изменяя фермент так, чтобы он сохранял активность, но терял способность к аллостерической реакции, можно получить суперпродуценты, когда избыток целевого продукта не будет влиять на интенсивность его синтеза. Этот метод широко используется в биотехнологическом производстве аминокислот, витаминов, антибиотиков и др.

Кроме того, при определенных условиях получают синхронные культуры, то есть культуры, в которых все клетки делятся одновременно (синхронно). Однако такая синхронность сохраняется, как правило, в течение 2-3 циклов деления, а затем она нарушается.

Дата добавления: 2014-01-07