Получение рекомбинантных белков с помощью прокариотических систем

Использование конститутивных промоторов не всегда оправданно, так как непрерывная экспрессия чужеродного гена может оказаться гибельной для клетки-хозяина из-за истощения ее ресурсов или нарушений метаболизма. Кроме того, плазмиды, несущие постоянно экспрессирующийся ген, нередко утрачиваются после нескольких клеточных циклов, поскольку не содержащие их клетки растут быстрее и со временем становятся в культуре преобладающими. Нужно, чтобы клонируемый ген работал только в определенной фазе цикла культивирования и только в течение определенного времени. Для этого нужно использовать сильные регулируемые промоторы. Плазмиды, сконструированные для этих целей, называются экспрессирующими векторами.

Лекция 12. Оптимизация экспрессии генов.

Чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Однако сам факт встраивания того или иного гена еще не означает, что этот ген будет работать. Для достижения эффективной экспрессии конструируют специальные вектора. Наиболее важны следующие свойства векторов:

1. тип промотора и терминатора транскрипции;

2. прочность связывания мРНК с рибосомой;

3. число копий клонированного гена и место его локализации (в плазмиде или в хромосоме клетки-хозяина);

4. эффективность трансляции;

5. конечная локализация и стабильность продукта в хозяйской клетке.

Для эффективной экспрессии любого гена необходимо наличие сильного регулируемого промотора, расположенного перед данным геном. Такой промотор активно связывается с РНК-полимеразой, поэтому прилегающие к нему последовательности транскрибируются с высокой частотой.

В зависимости от характера действия различают следующие виды промоторов.

Конститутивные промоторы активны во всех тканях растения на протяжении всего жизненного цикла его развития.

Активность тканеспецифичных промоторов ограничивается функционированием генов в какой-либо определенной ткани растения. Например, промоторы генов запасных белков, таких как глютелин риса, легумин-B4 бобовых, напин капусты и γ-кафирин сорго ограничивают экспрессию трансгена в запасных тканях семян. Промотор гена пататина В33 направляет синтез мРНК только в клубнях картофеля.

Индуцибельные промоторы активируют регулируемые ими гены в ответ на какой-нибудь сигнал: химическое воздействие, освещение, изменение температуры, заражение вирусом и т.п.

Для поиска промоторов геномную ДНК разрезают рестриктазами. К каждому из полученных фрагментов пришивают ген-репортер, кодирующий легко распознаваемый продукт (гены, обеспечивающие появление окраски или флуоресценции: GUS, ghp, lux и др.) или обеспечивающий устойчивость к токсичному веществу (антибиотику, токсину, гербициду и др.). Ген-репортер не имеет собственного промотора. Если репортерный ген активно экспрессируется, делают вывод о наличии сильного промотора в тестируемом фрагменте ДНК.

Наиболее широко используются следующие сильные регулируемые промоторы:

· промоторы lac- и trp-оперонов кишечной палочки;

· специально сконструированный tac-промотор, включающий -10 область lac-промотора и -35 область trp-промотора (участки, находящиеся на расстоянии 10 и 35 пар нуклеотидов до сайта инициации транскрипции);

· левый промотор бактериoфага лямбда p^L;

· промотор гена 10 бактериофага Т7.

Дата добавления: 2014-01-07