Разработали универсальные вектора на основе части концевого инвертированного повтора транспозона Tn5, который содержит два перекрывающихся промотора

Промоторы кишечной палочки могут быть неактивны в клетках других бактерий.

С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции.

Для получения больших к оличеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов кишечной палочки была сконструирована плазмида. Она содержит сильный промотор, селективный ген и короткий участок с сайтами для нескольких рестриктаз (полилинкер), следующий непосредственно за промотором. Эффективность этого экспрессирующего вектора можно еще повысить, заменив сайт инициации репликации аналогичным сайтом плазмиды pKN402. Это приводит к увеличению числа копий плазмиды в несколько раз при температуре 42 градуса. Полученная таким образом плазмида pCP3 содержит промотор p^L и ген лактамазы (ген устойчивости к ампициллину) из pPLc2833, а сайт инициации транскрипции – из pKN402. Несущие ее клетки сначала выращивают при температуре 28 градусов, затем повышают температуру до 42 градусов и получают экспрессию введенного в область полилинкера гена.

Плазмида	Число копий на клетку	Промотор p^L
28^оС	42^оС
pKN402			Нет
pPLc2833			Да
pCP3			Да

Для крупномасштабного производства белков была разработана двухплазмидная система. Ген репрессора cI поместили под контроль триптофанового промотора и включили в малокопийную плазмиду, что обеспечило невысокий уровень синтеза репрессора. Вторая плазмида содержала клонированный ген, находящийся под контролем p^L промотора. В отсутствие триптофана включается trp-промотор и синтезируется репрессор cI, выключающий p^L промотор. И наоборот, при наличии триптофана репрессор не синтезируется и p^L промотор активно работает. Культуры с такими двухплазмидными системами можно выращивать на недорогих средах на основе гидролизатов мелассы и казеина, содержащих незначительное количество свободного триптофана, и индуцировать экспрессию целевого гена добавлением в среду триптофана.

Промотор	Активность β-галактозидазы, ЕД
E.coli	Rhizobium melitoti	R.leguminosarum	Pseudomonas putida
Отсутствует
Nm
Lac
Tac
S1

Обычно уровень экспрессии гена пропорционален числу копий транскрибируемого гена. Поэтому с увеличением числа копий плазмиды со встроенным геном должно увеличиваться количество продукта. Но увеличение количества плазмид в клетке замедляет ее деление, может вызвать нарушения метаболизма или потерю плазмид. Решение вопроса – встраивание в малокопийную плазмиду нескольких копий целевого гена в тандемной ориентации.

Дата добавления: 2014-01-07