Студопедия

КАТЕГОРИИ:


Архитектура-(3434)Астрономия-(809)Биология-(7483)Биотехнологии-(1457)Военное дело-(14632)Высокие технологии-(1363)География-(913)Геология-(1438)Государство-(451)Демография-(1065)Дом-(47672)Журналистика и СМИ-(912)Изобретательство-(14524)Иностранные языки-(4268)Информатика-(17799)Искусство-(1338)История-(13644)Компьютеры-(11121)Косметика-(55)Кулинария-(373)Культура-(8427)Лингвистика-(374)Литература-(1642)Маркетинг-(23702)Математика-(16968)Машиностроение-(1700)Медицина-(12668)Менеджмент-(24684)Механика-(15423)Науковедение-(506)Образование-(11852)Охрана труда-(3308)Педагогика-(5571)Полиграфия-(1312)Политика-(7869)Право-(5454)Приборостроение-(1369)Программирование-(2801)Производство-(97182)Промышленность-(8706)Психология-(18388)Религия-(3217)Связь-(10668)Сельское хозяйство-(299)Социология-(6455)Спорт-(42831)Строительство-(4793)Торговля-(5050)Транспорт-(2929)Туризм-(1568)Физика-(3942)Философия-(17015)Финансы-(26596)Химия-(22929)Экология-(12095)Экономика-(9961)Электроника-(8441)Электротехника-(4623)Энергетика-(12629)Юриспруденция-(1492)Ядерная техника-(1748)

Разработали универсальные вектора на основе части концевого инвертированного повтора транспозона Tn5, который содержит два перекрывающихся промотора

Промоторы кишечной палочки могут быть неактивны в клетках других бактерий.

С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, которые опосредуют включение и выключение транскрипции.

Для получения больших к оличеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов кишечной палочки была сконструирована плазмида. Она содержит сильный промотор, селективный ген и короткий участок с сайтами для нескольких рестриктаз (полилинкер), следующий непосредственно за промотором. Эффективность этого экспрессирующего вектора можно еще повысить, заменив сайт инициации репликации аналогичным сайтом плазмиды pKN402. Это приводит к увеличению числа копий плазмиды в несколько раз при температуре 42 градуса. Полученная таким образом плазмида pCP3 содержит промотор pL и ген лактамазы (ген устойчивости к ампициллину) из pPLc2833, а сайт инициации транскрипции – из pKN402. Несущие ее клетки сначала выращивают при температуре 28 градусов, затем повышают температуру до 42 градусов и получают экспрессию введенного в область полилинкера гена.

Плазмида Число копий на клетку Промотор pL
28оС 42оС
pKN402     Нет
pPLc2833     Да
pCP3     Да

Для крупномасштабного производства белков была разработана двухплазмидная система. Ген репрессора cI поместили под контроль триптофанового промотора и включили в малокопийную плазмиду, что обеспечило невысокий уровень синтеза репрессора. Вторая плазмида содержала клонированный ген, находящийся под контролем pL промотора. В отсутствие триптофана включается trp-промотор и синтезируется репрессор cI, выключающий pL промотор. И наоборот, при наличии триптофана репрессор не синтезируется и pL промотор активно работает. Культуры с такими двухплазмидными системами можно выращивать на недорогих средах на основе гидролизатов мелассы и казеина, содержащих незначительное количество свободного триптофана, и индуцировать экспрессию целевого гена добавлением в среду триптофана.

Промотор Активность β-галактозидазы, ЕД
E.coli Rhizobium melitoti R.leguminosarum Pseudomonas putida
Отсутствует        
Nm        
Lac        
Tac        
S1        

Обычно уровень экспрессии гена пропорционален числу копий транскрибируемого гена. Поэтому с увеличением числа копий плазмиды со встроенным геном должно увеличиваться количество продукта. Но увеличение количества плазмид в клетке замедляет ее деление, может вызвать нарушения метаболизма или потерю плазмид. Решение вопроса – встраивание в малокопийную плазмиду нескольких копий целевого гена в тандемной ориентации.

<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>
Получение рекомбинантных белков с помощью прокариотических систем | Получение рекомбинантных белков с помощью эукариотических систем
Поделиться с друзьями:


Дата добавления: 2014-01-07; Просмотров: 298; Нарушение авторских прав?; Мы поможем в написании вашей работы!


Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет



studopedia.su - Студопедия (2013 - 2024) год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! Последнее добавление




Генерация страницы за: 0.01 сек.