Ферменты – биологические катализаторы

Лекция 6.

Вопросы для повторения

1.В чем смысл эпохи Возрождения и гуманизма?

2.Почему Возрождение возникло в Италии?

3.Какую роль сыграла Реформация в экономической жизни Европы?

4.Расскажите о двух этапах периода Возрождения.

5.Назовите причины Великих географических открытий.

6.Перечислите последствия Великих географических открытий.

7.Какую роль в экономическом развитии Европы сыграла «революция» цен?

Вот теперь мы дошли до самой удивительной функции белков – их работы в качестве ферментов. Ферменты – это биологические катализаторы. Их каталитическая активность уникальна, часто она оказывается гораздо выше, чем у любых искусственных катализаторов. У них очень высокая специфичность к субстратам, они катализируют специфические химические реакции. Работают они в водных растворах, им требуется очень узкий диапазон температур и рН. Почему? Для работы фермента необходима их нативная конформация. Если фермент денатурировать, большая часть активности теряется. Если порезать на аминокислоты – совсем ничего не останется. Ферменты в клетке работают согласованно, осуществляют цепочки последовательных реакций. Так устроены метаболические пути расщепления питательных веществ, запасания энергии, синтеза биополимеров из мономерных звеньев. Всё делают ферменты. Некоторые ферменты несут регуляторную функцию. Они отвечают на получаемые сигналы путём изменения каталитической активности. С их помощью ферментативные системы становятся высоко координированными и обеспечивают взаимодействие различных метаболических путей, необходимых для поддержания жизни.

Солидная часть истории биохимии приходится на историю изучения ферментов. Впервые биологические катализаторы были замечены и описаны еще в начале 19 века в процессе изучения переваривания мяса желудочным соком и превращения крахмала в сахар слюной. В 1850 году Луи Пастер открыл, что дрожжи превращают сахар в спирт с помощью «ферментов». Позднее они получили название энзимов. Он считал, что эти агенты неотделимы от самих дрожжей. Эта точка зрения сохранялась до тех пор, пока Эдвард Бухнер в 1897 году не открыл, что экстракты дрожжей могут делать то же самое. Первым ферментом, который был выделен, очищен и закристаллизован была уреаза, и случилось это уже в 1926 году. Это был прорыв в исследовании ферментов, попутно было установлено, что кристаллы состоят из чистого белка. Правда, до тех пор, пока не были выделены и закристаллизованы пепсин и трипсин точка зрения о том, что все ферменты – исключительно белки, считалась спорной.

Из правила, что все ферменты – белки есть правда одно исключение. Это каталитически активные РНК, и РНК, входящие в состав рибосом.

Молекулярный вес ферментов от 12000 до 1 млн. Некоторые ферменты – чистые полипептидные цепи, им больше ничего не нужно. Другим требуются дополнительные химические компоненты, кофакторы. Это может быть ион металла, или комплекс органических или металлоорганических молекул, кофермент. Кофермент или ион металла, ковалентно связанный с белком, называется простетической группой. Полный, каталитически активный фермент (полипептидная часть вместе с коферментом или ионом металла) называется холофермент. Пептидная часть такого фермента называется апофермент или апопротеин.

Как классифицировать ферменты так, чтобы не утонуть во всём множестве их названий, и как по названию фермента понять, что он делает?

Ферменты классифицируют по типу реакций, которые они осуществляют. Многие ферменты имеют окончание «аза». Его часто прибавляют к названию его субстрата или к типу реакции, которую он катализирует. Например, целлюлаза расщепляет целлюлозу, ДНК-полимераза удлиняет ДНК, киназы – фосфорилируют (кинируют), фосфатазы отщепляют фосфатные группы, синтазы что-то синтезируют. Чтобы не запутаться, ферменты классифицируют, деля на классы и подклассы, и присваивают им четырёхзначные номера, т.е. как бы координаты в четырехмерном пространстве. Первая цифра относится к классу (1 – оксидоредуктазы, осуществляют редокс реакции с переносом электронов; 2 – трансферазы, переносят группы; 3 – гидролазы, проводят гидролиз, разложение водой; 4 – лиазы, образуют двойные связи, перенося оттуда группы, или наоборот; 5 – изомеразы; 6 – лигазы, сшивают в результате реакции конденсации С-С, С-О, С-N, С-S). В процессе рассмотрения мы познакомимся со многими ферментами, научимся по обычному названию понимать функцию.

Каков же механизм работы ферментов?

Для ферментативных реакций характерно, что они протекают в ограниченном пространстве, на поверхности фермента (E) (а точнее у него внутри) в месте, называемом активным центром. То вещество, которое туда связывается, и с которым происходит реакция, называется субстратом (S). Простейшую ферментативную реакцию можно записать в виде E + S «ES «E + P.

Ферменты меняют только скорость реакции, в этом и заключается их функция, они не смещают самого равновесия. Чем определяется константа равновесия? Изменением свободной энергии при стандартных условиях. Стандартные условия: Т=298 К, давление газов 1 атм, концентрации компонент 1М, pH 7. Как совместить рН 7 и 1М для протонов? Никак, поэтому выбирают рН 7, потому что это естественные условия. Изменение свободной энергии при стандартных условиях – внутреннее свойство реакции, никакой катализатор его изменить не может. Правильное смещение равновесия еще не означает, что реакция пойдёт быстро.

Вывод 1: Ферменты не смещают равновесия, а только увеличивают скорость реакции.

От чего зависит скорость реакции? Совсем от другого параметра. А именно, от энергии, необходимой для образования так называемого переходного состояния. Рассмотрим схему зависимости свободной энергии от координаты реакции. Переходное состояние – это не химическое соединение, и его не надо путать с промежуточными продуктами. В переходном состоянии происходит разрыв связей, образование связей, перераспределение зарядов. Это неустойчивое состояние, из которого система с равной вероятностью может вернуться либо в состояние субстрата, либо продукта. Энергией активации называется разность энергии между нижним состоянием и переходным состоянием. Именно эта величина определяет скорость реакции. Чем больше энергия активации, тем медленнее протекает реакция. Скорость реакции можно повысить за счет увеличения температуры. Другой способ ускорить реакцию – понизить энергию активации путём добавления катализатора. Именно это и делают ферменты. Они понижают энергию активации. Если повысить химический потенциал субстрата, энергия активации уменьшится, и реакция пойдёт быстрее. Можно повысить концентрацию, а значит и свободную энергию продукта. Тогда DG изменит знак, и реакция пойдёт в другую сторону. Вывод: тот же фермент в принципе может катализировать и обратную реакцию.

Вывод 2: ферменты понижают активационный барьер.

Реакция при участии фермента протекает в несколько стадий, с образованием промежуточных продуктов. Это будут комплексы фермент-субстрат и фермент-продукт. Если реакция протекает в несколько стадий, то общая скорость реакции будет определяться самой медленной стадией, т.е. стадией с самым высоким активационным барьером. Эта стадия называется лимитирующей. Зачем нужны активационные барьеры? Они жизненно необходимы для стабильности молекул. Чем выше активационный барьер, тем стабильнее молекула.

Скорость реакции это количество субстрата, прореагировавшего в единицу времени. Скорость реакции зависит от концентрации продукта и константы скорости реакции k. Если в реакцию входят два соединения, то скорость пропорциональна произведению концентраций.

Теперь мы поняли, что делают ферменты, давайте посмотрим, как они это делают. Каталитическая активность – это действительно удивительное свойство, ведь они могут увеличивать скорость превращения от 7 до 14 порядков. Центральное место в этом процессе занимает образование фермент-субстратного комплекса ES. Именно это отличает ферменты от прочих, неорганических катализаторов. Взаимодействие между ферментом и субстратом определяется теми же «слабыми» силами, которые стабилизируют третичную структуру белка. Энергия, извлекаемая из фермент-субстратного взаимодействия, называется энергией связывания. Значимость ее не только в стабилизации фермент-субстратного комплекса, а главное то, что она является источником свободной энергии, с помощью которой ферменты понижают активационный барьер реакции. Одной из ранних идей, принадлежавших Эмилю Фишеру (1890 г.), была идея соответствия «ключ-замок», т.е. представление о полной комплиментарности между ферментом и субстратом. Однако эта идея оказывается тупиковой. Если бы субстрат подходил к ферменту, как ключ к замку, этот фермент никогда не смог бы осуществить каталитическую функцию, обе молекулы бы навсегда остались в этом состоянии. Система оказывается в потенциальной яме, из которой ей не выбраться. Рассмотрим реакцию по переламыванию палки. Пусть у фермента есть полость, полностью соответствующая форме палки. Тогда палка займёт эту полость, и навсегда останется там, держась на условных «магнитах». Она никогда не сломается. Это состояние будет соответствовать потенциальной яме на графике, из которой система имеет очень мало шансов выбраться.

Позднее Полинг понял, что фермент должен быть комплиментарен переходному состоянию. Все энергетически выгодные взаимодействия должны происходить только в переходном состоянии. Т.е. минимум потенциальной энергии соответствует переходному состоянию.

Однако, остается вопрос, как теперь оторвать полученный продукт от фермента? Здесь нам на помощь приходит теория индуцированного соответствия, предложенная Кошландом в 1958 году, согласно которой полная комплиментарность может наступить только при деформации фермента, вызванной связыванием субстрата.

Вывод 3: фермент испытывает конформационный переход.

Почему ферменты высоко специфичны? Те же самые взаимодействия, которые обеспечивают понижение активационного барьера, обеспечивают и специфичность действия фермента. Если фермент имеет такую пространственную структуру, которая обеспечивает образование связей между соответствующими группами фермента и субстрата, что повышает энергию связи, то такая структура одновременно не позволяет образовывать связи с другим субстратом. Чем лучше замок подходит к одному ключу, тем сложнее вставить туда любой другой. Т.е. чем лучше каталитические свойства для одного субстрата, тем хуже они для другого, т.е. тем выше специфичность. Здесь полезно вспомнить и про стереоспецифичность, про зеркальную симметрию.

Вывод 4: чем эффективнее действие фермента, тем специфичнее он к данному субстрату.

А что мешает протеканию реакций? Какие еще факторы, помимо наличия активационного барьера, помогают преодолеть ферменты?

1. энтропия. Из-за беспорядочного движения в растворе, вероятность столкновения двух молекул субстрата, да еще в правильной ориентации очень мала. Фермент обеспечивает правильную взаимную ориентацию и удерживает в этом положении.

2. сольватная оболочка. Фермент-субстратное взаимодействие замещает водородные связи с растворителем на водородные связи с ферментом.

3. электронное и структурное возмущение субстрата. Фермент-субстратное взаимодействие компенсирует напряжение или изменения, которым должен подвергнуться субстрат.

4. необходимость правильной ориентации относительно каталитических функциональных групп фермента, фермент сам деформируется. Это и есть так называемое индуцированное соответствие.

Рассмотрим подробнее кинетику. Скорость реакции зависит от концентрации субстрата, но концентрация меняется в процессе превращения субстрата в продукт. Для упрощения возьмем большую начальную концентрацию субстрата, чтобы ее относительные изменения были невелики. При этом равновесие сместится в сторону образования ES. Максимальная скорость реакции наблюдается тогда, когда почти весь фермент находится в виде комплекса, а концентрация свободного фермента исчезающе мала. Это кинетика насыщения, когда весь фермент насыщен субстратом. Дальнейшее увеличение концентрации S уже не влияет на скорость реакции. Когда ES комплекс распадается с образованием продукта, фермент освобождается и может катализировать новую реакцию. Вскоре после добавления к ферменту избытка субстрата концентрация комплекса перестает расти и практически не меняется со временем. Это стационарное состояние, и нас будет интересовать кинетика именно этого состояния и скорость реакции в этом состоянии. Давайте выведем уравнение Михаэлиса-Ментен. На ранних стадиях реакции концентрация продукта мала, и обратную реакцию можно не рассматривать, она очень медленная.

Соответствует ли полученное уравнение экспериментальным данным? Да.

Поясним смысл константы Михаэлиса: К_m = [S], когда V_o=1/2 V_max. Это способ определения константы скорости. Можно построить график 1/V_o от 1/S. Очень удобно для определения констант К_m и V_max.

Turnover number для фермента - это количество молекул, преобразуемых одной молекулой фермента в единицу времени в случае насыщения. Для систем, подчиняющихся кинетике ММ, это V_m/E_общ. Чему может быть равно это число? Для каталазы (чемпиона в этом смысле) 40000000/s, фумараза 800, для RecA 0.4.

Регуляторные ферменты. Зачем они нужны? Их активность может меняться в ответ на внешний сигнал. С их помощью регулируется скорость работы метаболических цепей. В большинстве цепей первый фермент является регуляторным. Чтобы попусту не тратить ресурсы даже на несколько реакций.

Аллостерические ферменты. Аллостерический – значит «в другой форме». Аллостерические ферменты связывают некий агент, называемый модулятором, обратимо и нековалентно, что приводит к изменению его активности. Другой класс ферментов связывает модулятор ковалентно, но тоже обратимо. Чаще всего у аллостерических ферментов несколько субъединиц, и сайты связывания модулятора находятся в другой субъединице, нежели каталитический сайт. В зависимости от оказываемого эффекта модуляторы могут быть ингибиторными или стимуляторными.

Ферменты можно ингибировать обратимо или необратимо. Что интересного в ингибировании ферментов? Лекарства, например. Обратимое ингибирование. Конкурентное ингибирование имеет место, когда посторонний агент, похожий на субстрат, занимает активный центр. С этим можно бороться, повышая концентрацию субстрата, чтобы вероятность связывания ингибитора уменьшалась. Это отразится на кинетике. Концентрация, при которой V_o достигает значение1/2 V_max, увеличится. Так можно диагностировать присутствие ингибитора. Пример – метанол-этанол для фермента алкоголь дегидрогеназы.

Неконкурентное (аллостерическое) ингибирование. Ингибитор связывается с сайтом, отличным от каталитического, но всё равно дезактивирует фермент вне зависимости от присутствия субстрата, вызывая конформационный переход и лишая фермент возможности связывать субстрат. При этом ингибитор снижает эффективную концентрацию фермента. Следовательно, уменьшается V_max. На К_m это почти не влияет.

Существует еще один вид ингибирования, когда ингибитор связывается тоже в отличном от каталитического сайте, но связывать может только фермент-субстратный комплекс ES.

Дата добавления: 2014-01-07