А.И.Арчакову и О.Н.Любимцевой

Изучение обмена нуклеиновых кислот и нуклеотидов

Распад нуклеиновых кислот и их мономеров до конечных продуктов можно выразить следующей схемой:

Нуклеиновые → Нуклеотиды → Пурины, → Мочевая кислота,

кислоты пиримидины β-аланин и аммиак

О состоянии нуклеинового и нуклеотидного обмена судят по активности ферментов, участвующих на разных стадиях их распада и превращения, а также по содержанию мочевой кислоты – конечного продукта обмена пуриновых оснований.

Работа 63. Определение активности кислой дезоксирибонуклеазы (ДНКазы) в сыворотке крови по А.А.Покровскому,

Реактивы. ДНК, 1 г/л раствор в ацетатном буфере, 0,1 М с рН 5,0; хлорная кислота, 0,5 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; термостат, отрегулированный на 37˚С; холодильник; центрифуга с центрифужными весами; часы; спектрофотометр.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на спектрофотометрическом измерении при 260 нм кислоторастворимых продуктов гидролиза ДНК, образующихся под действием ДНКазы, содержащейся в исследуемом материале:

ДНК, ДНКаза

высокополимерная ———— (n + 1) фрагментов ДНК

+ nН₂О

Ход определения. В опытную и контрольную пробирки отмеривают по 1,2 мл раствора ДНК. Затем в опытную пробу добавляют 0,2 мл сыворотки крови и перемешивают содержимое встряхиванием.

Помещают обе пробы на 30 мин в термостат при 37˚С, после чего в контрольную пробирку приливают 1,6 мл хлорной кислоты и 0,2 мл сыворотки крови, а в опытную – такой же объем хлорной кислоты. Содержимое проб перемешивают.

Ставят пробирки на 30 мин в холодильник при 4˚С, а затем обе пробы центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин (для осаждения негидролизованной ДНК). Надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки и измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на спектрофотометре при 260 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет проводят по формуле

х =Е₂₆₀2∙500,

где х – активность ДНКазы в Е₂₆₀/г∙л;

2 – коэффициент пересчета на 1 час;

500 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

Оформление работы. Рассчитать активность фермента в исследуемом материале, сделать вывод о присутствии кислой ДНКазы в сыворотке крови и практическом значении работы.

Практическое значение работы. Кислая ДНКаза сосредоточена в лизосомах клеток различных тканей, поэтому в научных исследованиях определение этого энзима используют для контроля чистоты выделяемой фракции лизосом. Кроме того, кислая ДНКаза является индикатором повреждения или повышенной проницаемости мембран лизосом, что имеет практическое значение при оценке действия лизосомотропных препаратов и патологического процесса.

Работа 64. Определение содержания мочевой кислоты

в сыворотке крови по методу Мюллера и Зейферта

Реактивы. Реактив Фолина^*; трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; карбонат натрия, насыщенный раствор; мочевая кислота, стандартный раствор 0,02 мг/мл, свежеприготовленный.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на способности мочевой кислоты восстанавливать фосфорновольфрамовый реактив (реактив Фолина) с образованием соединений, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации данной кислоты.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят по 1,5 мл сыворотки крови, дистиллированной воды и трихлоруксусной кислоты. Содержимое пробирки перемешивают, через 5 мин центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об/мин.

Берут две чистые градуированные пробирки: опытную и стандартную; добавляют в них реактивы в соответствии с таблицей.

Реактив	Опыт	Стандарт
Центрифугат, соответствующий 0,5 мл сыворотки	1,5 мл	-
Стандартный раствор мочевой кислоты	-	0,5 мл
Трихлоруксусная кислота	-	0,5 мл
Дистиллированная вода	-	0,5 мл
Насыщенный раствор карбоната натрия	0,7 мл	0,7 мл
Реактив Фолина (осторожно!)	1 капля	1 капля

Через 10 мин обе пробы фотометрируют против воды на ФЭКе при 510-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет проводят по формуле

Е_оп0,01∙2000

х = —————,

Е_ст¹⁶⁸

где х – содержание мочевой кислоты в сыворотке крови, ммоль/л;

Е_оп – экстинкция опытной пробы;

Е_ст – экстинкция стандартной пробы;

0,01 – масса мочевой кислоты в пробе стандартного раствора, взятого для реакции, мг;

2000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

168 – молекулярная масса мочевой кислоты.

Оформление работы. Рассчитать содержание мочевой кислоты в сыворотке крови и сделать вывод о возможных изменениях пуринового обмена.

Практическое значение работы. В норме содержание мочевой кислоты в сыворотке крови составляет 0,10-0,40 ммоль/л, а с мочой выделяется 2,36-5,9 ммоль в сутки. Повышенное содержание мочевой кислоты наблюдается в крови и моче при многих патологических состояниях, связанных с усиленным распадом нуклеопротеидов (лейкозах, диабете, аллергии и др.). Резко увеличивается концентрация мочевой кислоты при подагре, это сопровождается отложением солей мочевой кислоты в суставах и различных тканях организма. Понижение содержания мочевой кислоты в сыворотке крови отмечается при анемии, после приема пиперазина, атофана, салицилатов и кортикотропина (АКТГ).

Дата добавления: 2014-11-06