Исследование общих продуктов азотистого обмена

Некоторые продукты обмена азотистых соединений являются общими как для белковых, так и небелковых веществ. В клинико-биохимических лабораториях с целью диагностики нарушений обмена азотсодержащих соединений чаще всего определяют такие показатели, как остаточный азот, мочевину, аммиак. Остаточный азот – это азот небелковых соединений, остающихся в экстракте после полного осаждения белков крови. В состав остаточного азота входит азот мочевины, пептидов, аминокислот, аммиака, креатина, креатинина, индикана, билирубина и других азотсодержащих низкомолекулярных веществ.

Работа 60. Количественное определение остаточного азота

в крови фотоколориметрическим методом

Реактивы. Реактив Несслера^*; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; серная кислота, конц.; пероксид водорода, 30%-ный раствор; гидроксид натрия, 0,4 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1, 5 и 10 мл; глазные пипетки; центрифуга с центрифужными весами; песчаная баня; ФЭК.

Материал. Кровь, взятая из пальца.

Метод основан на способности аммиака, образующегося в результате минерализации безбелковых азотсодержащих соединений крови, давать с реактивом Несслера соединение желтого цвета, интенсивность которого пропорциональна концентрации остаточного азота.

Ход определения. В центрифужную пробирку наливают 0,5 мл дистиллированной воды, берут из пальца обследуемого микропипеткой 0,2 мл крови и вносят ее в пробирку, несколько раз промывая микропипетку содержимым.

В пробу добавляют 1,3 мл раствора трихлоруксусной кислоты, содержимое перемешивают стеклянной палочкой и оставляют осаждаться белки в течение 20 мин, затем центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин и сливают в чистую пробирку надосадочную жидкость.

Отбирают 1 мл безбелкового центрифугата в другую пробирку, приливают к нему 3 капли концентрированной серной кислоты и 2 капли раствора пероксида водорода. Ставят пробирки примерно на 30 мин в песчаную баню для минерализации содержимого (до полного просветления раствора).

После охлаждения пробирки до комнатной температуры в нее вносят 10 мл дистиллированной воды, тщательно снимают со стенок минерализат стеклянной палочкой и перемешивают.

Приливают в пробирку по 0,5 мл раствора гидроксида натрия и реактива Несслера. После появления желтого окрашивания фотометрируют опытную пробу против контрольной (10 мл дистиллированной воды и 0,5 мл реактива Несслера) на ФЭКе при 610-650 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 2 см.

Расчет производят по формуле

m2∙5000

х = —————,

1∙1000

где х – концентрация остаточного азота в крови, г/л;

m – содержание азота в пробе, найденное по калибровочному графику (рис.10), мг;

5000 – коэффициент пересчета на 1 л крови;

2 – объем уксусного экстракта, мл;

1 – объем безбелкового центрифугата, взятого на анализ, мл.

После упрощения формула приобретает следующий вид:

х = m10.

Оформление работы. По экстинкции рассчитать содержание азота в крови, сравнить его с нормой и сделать вывод о возможных отклонениях.

Практическое значение работы. За норму принимается содержание остаточного азота в крови в пределах 0,2-0,4 г/л. Повышение остаточного азота в крови – азотемия – бывает абсолютная и относительная. Абсолютная вызывается задержкой азотистых шлаков или повышенном образованием их в организме; относительная наблюдается при обезвоживании организма (неукротимая рвота, усиленное потоотделение и др.).

Различают почечную и внепочечную азотемию. Первая наблюдается при нарушении выделительной способности почек (острые и хронические нефриты), причем степень азотемии соответствует тяжести патологического процесса. Внепочечная является следствием повышенного распада белков в организме при лихорадочных состояниях, ожогах, диабете, тяжелых поражениях печени и т.д.

Работа 61. Количественное определение мочевины

в сыворотке крови и моче

Реактивы. Цветной реактив^*; мочевина, стандартный раствор 1 г/л, или 16,65 ммоль/л; набор «Уреатест».

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1, 2 и 5 мл; алюминиевая фольга; водяная баня; ФЭК.

Материал.

1. Сыворотка крови.

2. Моча, собранная за сутки, профильтрованная и разведенная перед анализом водой в 25 раз.

а. Определение содержания мочевины в сыворотке крови. Метод основан на способности мочевины в присутствии тиосемикарбазида и солей железа в сильнокислой среде образовывать с диацетилмонооксимом соединение красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины в исследуемой жидкости.

Ход определения. В опытную пробирку отмеривают 0,1 мл разведенной в 10 раз сыворотки крови, в стандартную – такой же объем стандартного раствора мочевины и в контрольную – 0,1 мл дистиллированной воды. Добавляют во все пробирки по 2 мл цветного реактива и тщательно перемешивают их содержимое встряхиванием.

Все пробирки закрывают крышечкой из алюминиевой фольги и нагревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин (точно!). Затем охлаждают их под струей холодной воды.

Измеряют экстинкцию стандартной и опытной проб против контрольной на ФЭКе при 540-560 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Примечание. Окраска неустойчива, поэтому измерение необходимо провести в течение 15 мин.

Расчет. Содержание мочевины х (ммоль/л) в сыворотке крови рассчитывают по формуле

Е_оп16,65∙10

х = —————,

Е_ст

где Е_оп – экстинкция опытной пробы против контрольной;

Е_ст – экстинкция стандартной пробы против контрольной;

16,65 – концентрация мочевины в стандартной пробе, ммоль;

Азот мочевины (в ммоль/л) рассчитывают, разделив полученное значение содержания мочевины в сыворотке на 2,14 (число, выражающее отношение молекулярной массы азота мочевины к массе всей молекулы мочевины).

б. Определение содержания мочевины в моче. Принцип метода тот же, что и в предыдущей работе.

Ход определения. Для анализа используют 0,1 мл разведенной мочи и 0,1 мл стандартного раствора мочевины и обрабатывают эти пробы так же, как и сыворотку крови.

Расчет проводят по формуле

Е_опV25∙1,665

х = —————,

Е_ст0,1∙1000

где х – количество мочевины, ммоль/сут;

V – объем суточной мочи;

1,665 – содержание мочевины в 0,1 мл стандартной пробы, мкмоль;

Е_оп – экстинкция опыта;

Е_ст – экстинкция стандарта;

0,1 – объем мочи, взятый на исследование, мл;

1000 – коэффициент пересчета мкмоль в ммоль.

в. Определение содержания мочевины в сыворотке крови экспресс-методом с помощью набора «Уреатест». Метод основан на способности уреазы разлагать мочевину с образованием аммиака, который окрашивает полоску реактивной хроматографической бумаги в голубой цвет. Высота окрашенной зоны пропорциональна концентрации мочевины, которую рассчитывают по калибровочному графику.

Ход определения. Сыворотку крови разводят водой в отношении 1:1. На пропитанный ферментом конец бумажной полоски в 3 мм от красной парафиновой полосы наносят специальной пипеткой 0,03 мл разведенной сыворотки крови. Полоску тотчас помещают в чистую сухую пробирку, герметически закрывают ее пробкой и ставят в термостат при 37˚С. Через 20 минут полоску извлекают, измеряют высоту окрашенной в голубой цвет зоны.

Расчет. По калибровочному графику, входящему в набор «Уреатест», находят концентрацию мочевины в сыворотке крови.

Оформление работы. Сделать расчет содержания мочевины и азота мочевины в исследуемой сыворотке и моче. В выводе отметить возможные изменения в азотном обмене.

Практическое значение работы. В норме содержание мочевины в сыворотке крови человека составляет 3,0-7,0 ммоль/л, а азота мочевины – 1,2-3,7 ммоль/л. Содержание мочевины в сыворотке крови значительно колеблется в зависимости от приема белков с пищей. Повышение уровня мочевины в крови (азотемия) отмечается при заболеваниях почек (когда нарушена их выделительная функция), при усиленном распаде белков, избыточном белковом питании, а также в случае обезвоживания организма (в данном случае имеет место относительная, а не абсолютная форма азотемии). Снижение уровня мочевины в крови и выделения ее с мочой (в сутки в норме выделяется 333-582,8 ммоль/сут) наблюдается при заболевании печени (паренхиматозная желтуха, дистрофия печени, цирроз), что связано с нарушением мочевинообразовательной функции.

Работа 62. Количественное определение креатина и креатинина

по методу Брауна

Реактивы. Пикриновая кислота, насыщенный раствор^*; соляная кислота, 0,1 моль/л; основной калибровочный раствор креатинина^*; 12,5% раствор едкого натрия.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки на 0,2; 1,0; 2,0 и 5,0 мл; ФЭК; водяная баня.

Материал. Исследуемая моча.

Принцип метода. Основан на способности креатинина в щелочной среде с пикриновой кислотой образовывать комплекс оранжевого цвета, интенсивность которого пропорциональна концентрации креатинина. Определение креатина проводится после перевода его в креатинин при нагревании мочи в солянокислой среде.

Ход определения. В три меченные обычные пробирки внести по 0,2 мл концентрированной соляной кислоты (осторожно, только пипеткой с резиновой грушей!). В 1-ю и 2-ю пробирки добавить по 0,2 мл исследуемой мочи, предварительно разведенной в 5 раз: 1 пробирка служит для определения креатинина, 2 – креатина, 3 – контрольная. Вторую пробирку нагреть в течение 5 минут на бурно кипящей водяной бане, после чего охладить под струей водопроводной воды. Во все пробирки внести дистиллированную воду в следующих количествах: первая пробирка – 2,0 мл, вторая – 2,0 мл, третья – 2,2 мл и в каждую добавить по 0,6 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты и по 1,0 мл 12,5% раствора гидроксида натрия, тщательно перемешивают. Оставляют стоять на 10 минут при комнатной температуре, после чего во все три пробирки добавляют по 6,0 мл дистиллированной воды. Оптическую плотность исследуемых растворов определяли на ФЭКе с длиной волны 507 нм в кювете на 10 м против контрольной пробы (третья пробирка). Количество определялось по калибровочному графику.

Расчет. Находят содержание свободного креатинина в первой пробирке по калибровочному графику, а затем, используя нижеприведенную формулу, проводят расчет:

a∙5∙1000∙5

х = ———————,

1000∙1000

где х – количество креатинина в г на 1 л мочи;

а – количество креатинина в мкг в 0,2 мл разведенной мочи, взятой для анализа;

5 – разведение мочи;

5 – для перевода количества креатинина с 0,2 мл мочи на 1 мл;

1000 – перерасчет на 1 л, числитель;

1000 – для перевода мкг в мг, знаменатель;

1000 – для перевода мг креатинина в г, знаменатель.

Расчет креатина – вторая пробирка содержит сумму свободного креатинина и креатинина, переведенного из креатина при нагревании в солянокислой среде. Из количества креатинина, полученного при определении суммы креатин-креатинин, вычитают количество параллельно исследуемого свободного креатинина и полученную разность умножают на 1,16 – коэффициент перевода креатинина в креатин.

Построение калибровочного графика: из рабочего калибровочного раствора креатинина готовят разведение, как указано ниже:

№№ пробы	Рабочий калибр. р-р креатинина, мл	Раствор пикриновой кислоты, мл	2,5 моль/л раствора NaOH, мл	Дистиллированная вода, мл	Концентр. креатинина в пробе, ммоль/л
	0,4	3,0	0,2	До объема 10 мл
	0,8	3,0	0,2
	1,6	3,0	0,2
	2,4	3,0	0,2
	3,2	3,0	0,2

Оформление работы. Рассчитать содержание креатина и креатинина в исследуемой пробе и в выводах дать оценку полученным результатам, сравнивая с нормой.

Практическое значение работы. Креатинин, наряду с мочевиной и солями аммония являются нормальными продуктами азотистого обмена и на его долю приходится около 2,5-7% всего азота мочи. Креатинина в норме выделяется с мочой: 4,4-17,7 ммоль/сутки или 0,5-2,0 г/сутки. В норме моча взрослых людей креатина не содержит. У детей имеет место физиологическая креатинурия, поэтому в моче он обнаруживается в небольших количествах. Появление креатина в моче взрослого человека связано с нарушением обмена креатина и наиболее часто встречается при поражении мышечной ткани (мышечная дистрофия, мышечная атрофия, миастения, миозит, миотония), Е-авитаминозе, при тонических судорогах, усиленном распаде тканевых белков. При этом содержание креатинина в моче понижается.

Дата добавления: 2014-11-06