Катепсины

Глобин ——————— (n + 1) Фрагменты глобина

+ nН₂О

Экстинкцию кислоторастворимых продуктов гидролиза глобина (пептиды, свободные аминокислоты) измеряют при 280 нм на спектрофотометре. В этой области спектра в основном поглощает тирозин и в меньшей степени триптофан и фенилаланин.

Ход определения. В опытную пробирку вносят 1 мл раствора гемоглобина и 0,5 мл сыворотки крови, а в контрольную – те же вещества в том же объеме и 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы перемешивают встряхиванием.

Ставят пробирки на 60 мин в водяную баню при 37˚С, после этого приливают к опытной пробе 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают содержимое встряхиванием. Центрифугируют пробы 10 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки.

Измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на спектрофотометре при 280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет. Проводят с использованием калибровочного графика на тирозин или молярного коэффициента экстинкции тирозина:

Е5000

х = ——————,

0,436

где х – активность катепсинов, ммоль тирозина/(ч∙л);

Е – экстинкция опытной пробы против контрольной;

5000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

0,436 – коэффициент экстинкции 1 ммоля тирозина.

Оформление работы. По экстинкции рассчитать активность катепсинов в сыворотке крови, сделать вывод и отметить практическое значение определения данного фермента.

Практическое значение работы. Катепсины, гидролизующие белки в кислой зоне рН, специфичны для лизосом тканей, поэтому в научных исследованиях их определяют как индикаторы чистоты лизосомальной фракции. При поражении органов, особенно при некрозах, активность катепсинов в сыворотке крови увеличивается. Это явление отмечено при инфаркте миокарда, причем степень повышения ферментативной активности в сыворотке крови зависит от глубины и распространенности некротического очага в сердце.

Работа 57. Определение активности аспартат- и аланин­-

аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю

Реактивы. Субстратные растворы № 1 и № 2^*; 2,4-динитрофенилгидра­зин, 0,1%-ный раствор на 2 М растворе соляной кислоты; гидроксид натрия, 0,4 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на определении пировиноградной кислоты, которая является одним из продуктов реакции, катализируемой аланинаминотрансферазой, или продуктом декарбоксилирования оксалацетата, образующегося в реакции, катализируемой аспартатаминотрансферазой. Образовавшаяся пировиноградная кислота определяется по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (см. работу 31).

Ход определения. Определение активности ферментов проводят по схеме

Последовательность операций	АлАТ	АсАТ
опыт	контроль	опыт	контроль
Внесение субстратных растворов	Раствор № 1 – 0,5мл	Раствор № 1 – 0,5мл	Раствор № 2 – 0,5мл	Раствор № 2 – 0,5мл
Нагревание	5 мин при 37˚С	5 мин при 37˚С
Добавление 2,4-ДНФГ	-	1,0 мл	-	1,0 мл
Добавление сыворотки	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл
Инкубация	30 мин при 37˚С	60 мин при 37˚С
Добавление 2,4-ДНФГ	0,5 мл	-	0,5 мл	-
Экспозиция	20 мин при 18-20˚С	20 мин при 18-20˚С
Добавление гидроксида натрия	5,0 мл	5,0 мл	5,0 мл	5,0 мл
Экспозиция	10 мин при 18-20˚С	10 мин при 18-20˚С

Фотометрируют опытные пробы против контрольной на ФЭКе при 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет производят по формулам:

m10000 m10000∙2

х(АсАТ) = ———— или х(АлАТ) = ————,

1000 1000

где х – активность ферментов, ммоль/(ч∙л);

m – количество пировиноградной кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику (рис. 9), мкмоль;

10000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки;

1000 – коэффициент пересчета мкмоль в ммоль;

2 – для пересчета на 1 ч.

Практическое значение работы. В норме активность аланинаминотрансферазы составляет 0,1-0,68, а аспартатаминотрансферазы 0,1-0,45 ммоль/(ч∙л).

Определение активности АсАТ и АлАТ и их отношения широко используется в клинической практике для выявления патологических процессов в различных органах. В миокарде более высокая активность АсАТ, чем АлАТ, в печени обратное соотношение активности этих ферментов. При инфаркте миокарда значительно увеличивается активность АсАТ в сыворотке крови с одновременным повышением коэффициента АсАТ/АлАТ. При поражении печени (цирроз, сывороточный гепатит и т.д.) более выраженно повышается активность АлАТ и снижается коэффициент АсАТ/АлАТ.

Работа 58. Определение активности гистидазы в сыворотке крови

по Табору и Мелеру в модификации В.А.Буробина

Реактивы. L-гистидина моногидрохлорид, 0,2 М раствор (418 мг в 100 мл), доведенный с помощью 1 М раствора NaOH до рН 8,2; пирофосфатный буфер, 0,1 М раствор с рН 8,2^*; трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; активирующий раствор, содержащий восстановленный глутатион и альбумин^*; уроканиновая кислота, 0,001 М раствор для построения калибровочного графика (8,7 мг дигидрата уроканиновой кислоты растворяют в 0,001 М растворе NaOH в мерной колбе вместимостью 50 мл).

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; водяная баня с лабораторным термометром; термостат, отрегулированный на 37˚С; центрифуга с центрифужными весами; спектрофотометр.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на измерении экстинкции уроканиновой кислоты, образующейся из гистидина под действием гистидазы, в зоне ее максимального поглощения при 264 нм в кислой среде.

Ферментативная реакция протекает по уравнению

Ход работы. В две пробирки – контрольную и опытную – вносят по 0,3 мл пирофосфатного буфера, по 0,5 мл исследуемой сыворотки и по 1 мл активирующего раствора. В опытную пробирку приливают 1 мл раствора гистидина и доводят объем пробы до 3 мл дистиллированной водой. Перемешивают содержимое встряхиванием.

Обе пробирки помещают на 2 ч в водяную баню или термостат при 37˚С, затем добавляют в пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. После этого в контрольную пробу приливают 1 мл активирующего раствора, объем ее доводят до 3 мл дистиллированной водой и перемешивают содержимое встряхиванием.

Пробы центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, после чего надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки.

Измеряют экстинкцию опытной работы против контрольной на спектрофотометре при 264 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Для построения калибровочного графика в семь пронумерованных пробирок вносят компоненты, перечисленные в приведенной ниже таблице, в указанных количествах.

Для приготовления рабочего раствора уроканиновой кислоты берут ее исходный 0,001 М раствор и разбавляют в 10 раз дистиллированной водой.

Доводят объем всех проб до 3 мл дистиллированной водой, добавляют во все пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают содержимое. Центрифугируют пробы 5 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки и измеряют экстинкцию, как указано выше.

№№ пробы	Рабочий раствор уроканиновой кислоты, мл	Пирофосфатный буфер, мл	Активирующий раствор, мл	Раствор гистидина, мл	Содержание уроканиновой кислоты в пробе, мкмоль
		0,3	1,0	1,0
	0,05	0,3	1,0	1,0	0,005
	0,10	0,3	1,0	1,0	0,010
	0,15	0,3	1,0	1,0	0,015
	0,20	0,3	1,0	1,0	0,020
	0,30	0,3	1,0	1,0	0,030
	0,40	0,3	1,0	1,0	0,040

Расчет производят по формуле

Дата добавления: 2014-11-06