В сыворотке крови

Метод основан на определении концентрации органического фосфата, освободившегося при кислотном гидролизе. Измерение содержания неорганического фосфата проводится реакцией с молибдатом аммония, принцип которой см. работу 11.

Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 0,6 М раствор; реактив молибдата аммония^*; хлорная кислота, конц.; восстанавливающий реактив^*.

Оборудование. Фильтровальная бумага; центрифуга с центрифужными весами; штатив с пробирками; пипетки для забора концентрированных кислот; пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; песчаная баня; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Ход определения. В опытную пробирку вносят 0,2 мл сыворотки и 2,8 мл дистиллированной воды, в контрольную – 3 мл дистиллированной воды. Добавляют в обе пробирки по 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты и встряхивают для перемешивания содержимого.

Центрифугируют опытную пробу 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, пробирку переворачивают на фильтровальную бумагу до полного стекания жидкости. Затем в обе пробирки приливают по 1 мл концентрированной хлорной кислоты (специальной пипеткой, осторожно!), помещают в каждую из них по две стеклянные бусинки и встряхивают их содержимое. Пробы ставят на гидролиз в песчаную баню при 180˚С на 20-30 мин (до обесцвечивания раствора).

Пробирки охлаждают на воздухе до комнатной температуры, прибавляют по 3 мл дистиллированной воды, по 1 мл реактива молибдата аммония и по 1 мл свежеприготовленного восстанавливающего реактива. Тщательно перемешивают содержимое пробирок и оставляют на 10 мин при комнатной температуре.

Фотометрируют опытную пробу против контрольной на ФЭКе при 630 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет. Содержание общих фосфолипидов х (г/л) в сыворотке крови рассчитывают по формуле

m5000∙25

х = ——————,

где m – масса неорганического фосфата в пробе, найденная по калибровочному графику (рис. 8), мг;

5000 – коэффициент пересчета на литр сыворотки крови;

10 – коэффициент пересчета миллиграммов в граммы;

25 – коэффициент пересчета (липидный фосфор составляет 4% относительной молекулярной массы фосфолипидов).

Для пересчета липидного фосфора на ммоль/л необходимо полученные результаты умножить на коэффициент 0,323.

Оформление работы. По полученному значению экстинкции рассчитать содержание общих фосфолипидов и липидного фосфора в сыворотке крови. Сделать вывод относительно полученных данных.

Практическое значение работы. Фосфолипиды сыворотки (плазмы) крови входят в состав липопротеидов, обусловливая вместе с белком полярные свойства этих смешанных макромолекул и их растворимость. В норме содержание общих фосфолипидов составляет 1,5-3,6 г/л, или 2,0-3,5 ммоль/л липидного фосфора. Важным показателем является индекс фосфолипиды/холестерин, который в физиологических условиях равен 1-1,5. Этот индекс снижается при атеросклерозе, гипертонической болезни, заболеваниях печени. Повышение концентрации фосфолипидов в сыворотке крови (гиперфосфолипидемия) наблюдается при сахарном диабете, гипотиреозе, при поражении почек и т.д. Пониженный уровень их встречается при тяжелых формах острого гепатита, жировом перерождении печени, тиреотоксикозе.

Работа 54. Разделение липидов сыворотки крови

методом тонкослойной хроматографии

Метод основан на различной скорости перемещения липидных фракций сыворотки крови (фосфолипиды, свободные жирные кислоты, холестерин, глицериды) в тонком слое адсорбента при движении через него органического растворителя. Скорость разделения фракций зависит от их относительной полярности, и для их обнаружения полученные хроматограммы обрабатывают парами иода.

Реактивы. Этанол – диэтиловый эфир (3:1); хлороформ; растворитель для хроматографии: н-гексан – диэтиловый эфир – уксусная кислота (73:25:2); иод металлический.

Оборудование. Пластинки хроматографические Силуфол УФ₂₅₄; камера для хроматографии; водяная баня; камера для проявления хроматограмм; хроматоскоп.

Материал. Сыворотка крови.

Ход определения. В мерной колбе вместимостью 25 мл смешивают 1 мл исследуемой сыворотки крови с 10 мл приготовленной спирто-эфирной смеси. Колбу с содержимым помещают на 30 с в кипящую водяную баню, охлаждают под струей холодной воды и доводят объем спирто-эфирной смесью до 25 мл. Полученный липидный экстракт отфильтровывают через обезжиренный бумажный фильтр в широкогорлую пробирку, выпаривают досуха в кипящей водяной бане, а осадок растворяют в 0,2 мл хлороформа.

В хроматографическую камеру наливают 2-3 мл растворителя. Пастеровской пипеткой наносят на хроматографическую пластину, отступя 1 см от края, 0,01-0,02 мл хлороформного экстракта, помещают пластину в камеру этим концом вниз, погрузив его на 3-5 мм в растворитель. Камеру закрывают крышкой для поддержания равномерной концентрации паров. Хроматографию проводят при комнатной температуре до тех пор, пока фронт растворителя не приблизится к верхнему краю, не доходя до него 0,5 см.

Полученную хроматограмму извлекают из камеры, высушивают на воздухе и вносят в камеру для проявления, на дно которой предварительно насыпают кристаллы металлического иода. Сосуд закрывают и подогревают в водяной бане при 60˚С. Возгоняющийся иод вступает в реакцию с липидными фракциями.

Через 1 мин хроматограмму извлекают и просматривают в ультрафиолетовом свете на хроматоскопе. Фракции липидов обнаруживают в виде коричневых пятен. Ближе к линии старта расположены фосфолипиды, затем неидентифицированные соединения, холестерин, моноглицериды, свободные жирные кислоты, триглицериды и эфиры холестерина.

Оформление работы. Зарисовать полученную хроматограмму, указав на ней соответствующие липидные фракции сыворотки крови. Указать в выводах возможность дальнейшего количественного определения липидных компонентов.

Дата добавления: 2014-11-06