Метод выявления РНК окрашиванием метиловым зеленым — пнронином по Унне—Паппенгейму с контролем рибонуклеазой (реакция Браше)

Выявление дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) по методу Фёльгена.

Метод основан на том, что при кислотном гидролизе в ДНК освобождаются реакционноспособные альдегидные группы, которые затем реагируют с реактивом Шиффа.

Приготовление растворов: 1. Реактив Шиффа (фуксинсернистая кислота) по В. В. Яглову и JI. Н. Моралеву. 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл дистиллированной воды (комнатной температуры), тщательно взбалтывая в течение 3—5 мин. Раствор фильтруют через бумажный фильтр. К фильтрату добавляют 10 мл 1 н. хлористоводородной кислоты и 1 г метабисульфита калия или натрия. Раствор в хорошо закрытой колбе помещают в темное место на 24 ч. После обесцвечивания фуксина реактив приобретает желтоватый или коричневый цвет в зависимости от качества основного фуксина. Для окончательной очистки фуксина от примесей добавляют к нему 3—5 растолченных таблеток карболена, хорошо взбалтывают и отфильтровывают в склянку с притертой пробкой. Если полного обесцвечивания реактива не наступает, количество карболена можно увеличить. Реактив лучше хранить в холодильнике. С целью проверки качества полученного реактива Шиффа наливают в бюкс 5 мл реактива и добавляют в него 1 каплю неразведенного кислого формалина. Если реактив отличного качества, то он на глазах приобретает цвет основного фуксина.

2. Сернистая вода. К 200 мл дистиллированной воды добавляют 10 мл 10% раствора гидросульфита натрия (NaHS0₃) и 10 мл 1 н. раствора хлористоводородной кислоты. Сернистая вода готовится перед употреблением и должна обладать характерным запахом диоксида серы (сернистого ангидрида (SO₂).

Реакцию Фёльгена можно проводить после любого фиксатора, за исключением жидкости Буэна.

Методика проведения реакции: 1)депарафинированные парафиновые срезы из дистиллированной воды переносят для гидролиза в 1 н. хлористоводородную кислоту. Гидролиз производят в термостате при температуре 60° С в течение 8—15 мин (кислоту следует заранее согреть); 2) проводят обработку реактивом Шиффа при комнатной температуре в течение 40—80 мин. Склянка с реактивом должна быть защищена от света черной бумагой; 3) из реактива Шиффа срезы переносят в сернистую воду (ни в коем случае не споласкивая!) — 3—4 порции сернистой воды по 2 мин в каждой; 4) промывают в водопроводной воде в течение 10 мин; 5) обезвоживают в спиртах, помещают в ксилол, заключают в бальзам.

Результат: ядра окрашиваются в красный цвет.

Использовать метод окраски Унны—Паппенгейма для выявления РНК было предложено Браше. При этом из пары соседних срезов один обрабатывают рибонуклеазой для разрушения РНК. Затем оба среза окрашивают метиловым зеленым—пиронином и сравнивают. Материал, окрашивающийся в красный цвет пиронином и исчезающий на срезах, обработанных рибонуклеазой, представляет собой РНК. ДНК ядра красится метиловым зеленым в зеленый цвет. Во многих случаях, например при работе с нервной тканью, обработки рибонуклеазой не требуется, так как в ней нет других, кроме РНК, компонентов, окрашивающихся пиронином.

Наилучшим фиксатором для последующей реакции Браше является жидкость Карнуа. Фиксаторы, содержащие тяжелые металлы, негодны, так как тяжелые металлы образуют с РНК устойчивые к перевариванию рибонуклеазой комплексы.

Приготовление растворов. Метиловый зеленый необходимо очистить от образующегося в нем метилового фиолетового. Для этого порошок метилового зеленого заливают хлороформом (10—15 мл хлороформа на 0,1 г красителя), основательно взбалтывают и оставляют на 2—3 ч. Затем снова взбалтывают и фильтруют. Порошок красителя на фильтре еще несколько раз промывают хлороформом. Высушенный порошок используют для приготовления раствора красителя. Можно обрабатывать метиловый зеленый хлороформом и в растворе. В этом случае раствор взбалтывают с хлороформом в делительной воронке и отделяют отслаивающийся, окрашенный в фиолетовый цвет хлороформ. Процедуру повторяют несколько раз до тех пор, пока хлороформ не перестанет окрашиваться. Для приготовления раствора метилового зеленого пиронина 0,5 г метилового зеленого растворяют в 100 мл 0,1 М раствора ацетатного буфера с pH 4,4. К этому раствору прибавляют 0,2 г пиронина. Можно использовать и другую пропись: метилового зеленого 0,15 г, пиронина 0,25 г, спирта 96° 2,5 мл, глицерина 20 мл, 0,5% водного раствора карболовой кислоты 100 мл.

Методика окрашивания: 1) депарафинированные срезы из дистиллированной воды переносят в метиловый зеленый— пиронин на 1—2 ч и более (до 1 сут); 2) срезы быстро споласкивают водой, быстро обсушивают фильтровальной бумагой; 3) быстро (10—15 с) обезвоживают и дифференцируют в абсолютном спирте или в безводном ацетоне; 4) помещают в ксилол, заключают в бальзам.

Результат: ядра синевато-зеленые, РНК ядрышек и цитоплазмы розового цвета.

Ферментативный контроль. Срез обрабатывают в растворе рибонуклеазы в концентрации 0,1—0,5 мг/мл в термостате при 37° С в течение 4—8 ч. Участки клетки, содержащие РНК, после такой обработки пиронином не окрашиваются.

Реакция на РНК по Браше не подходит для количественного анализа. Значительно надежнее выявление нуклеиновых кислот с помощью галлоцианина и хромовых квасцов по Эйнарсону.

Дата добавления: 2014-11-25