И дезагрегации эритроцитов

НАНОМАТЕРИАЛОВ МЕТОДОМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИНЕТИКИ АГРЕГАЦИИ

ПОРЯДОК РЕГИСТРАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТИРОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ

------------------------------T----------T---------T----------T------

-----

¦ ¦ ¦ ¦

¦ -1 ¦

¦ ¦ kT, у.е. ¦ A, у.е. ¦ I, % ¦ бета,

с ¦

¦ ¦ ¦ ¦ 2,5

¦ ¦

+-----------------------------+----------+---------+----------+------

-----+

¦ Фон ¦ ¦ ¦

¦ ¦

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

+-----------------------------+----------+---------+----------+------

-----+

¦ Нано (различные концентрации) ¦ ¦ ¦

¦ ¦

+-----------------------------+----------+---------+----------+------

-----+

¦ К (различные концентрации) ¦ ¦ ¦

¦ ¦

L-----------------------------+----------+---------+----------+------

------

Примечание. Параметры: (kT) - характеризует время спонтанной

агрегации

эритроцитов; (A) - размер эритроцитарных агрегатов; (I

) -

2,5

гидродинамическую прочность наиболее крупных агрегатов;

(бета) -

гидродинамическую прочность основной массы агрегатов. Образцы

крови:

(Фон) - исходные; (Нано) - с замещением части плазмы на

препарат

наноматериала; (К) - с замещением части плазмы на раствор глицерина.

Статистический анализ данных проводят по плану,

представленному в п.

6.2.1.5. Предварительную оценку характера распределения данных

осуществляют

с помощью теста Shapiro-Wilk. В соответствии с полученным

результатом, при

дальнейшей обработке применяют непараметрические критерии или

критерии для

нормально распределенных данных. Достоверность различий средних

значений

нескольких групп данных оценивают по критерию Friedman. При

проведении

обобщенной оценки достоверность различия средних значений для

нескольких

групп данных определяют по критерию Kruskal-Wallis, а для 2-х групп

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

данных

- по критерию Mann-Whitney. Для анализа различий между двумя

группами

данных применяют парный t-критерий Student или непараметрический

критерий

Wilcoxon. Корреляционный анализ проводят с использованием

статистики

Spearman. Выводы считают достоверными при допустимой вероятности

ошибки

менее 0,05. Данные представляют в виде среднего

арифметического +/-

стандартное отклонение (SD). IC определяют предварительно

согласно

Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению

новых

фармакологических веществ / под общей ред. Хабриева Р.У. - 2 изд. -

М.: ОАО

"Издательство Медицина". - 2005. - 832 с.

Наноматериал признается безопасным по результатам тестирования, если интегральные

параметры (спонтанная агрегация (a), дезагрегация (d)) в опытных группах животных, подвергшихся

воздействию наноматериала, не отличаются достоверно от контроля.

6.4.2. Оценка деформационных свойств эритроцитов и вязкости крови

6.4.2.1. Принцип метода

Оценку деформационных свойств отдельных эритроцитов проводят методом эктацитометрии.

При этом на сильно разбавленную суспензию эритроцитов падает лазерный луч, создающий

дифракционную картину на отдельных клетках. Дифракционная картина соответствует контурам

эритроцита, которые по мере пошагового возрастания скорости сдвига, приобретают вид все более

уплощающегося овала. Изменение соотношения длины и ширины овала с изменением скорости

сдвига позволяет оценить способность клеток к деформации в сдвиговом потоке. В отличие от

метода втягивания мембраны эритроцита в микропипетку, метод эктацитометрии позволяет судить о

деформируемости, связанной не только с мембраной, но и с внутренним содержимым эритроцита. В

отличие от метода фильтрации клеток через узкие (для человека - через 5-микронные) отверстия,

метод эктацитометрии позволяет избегать неточностей, связанных с особенностями фильтрационных

измерений (закупоркой отверстий) и с математической обработкой данных.

Вязкость крови в целом оценивают на основании вышеописанных

измерений

гидродинамической прочности эритроцитарных агрегатов.

Параметр,

характеризующий эффективную вязкость крови, (k) находят на

основании

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

параметров, отражающих размер агрегатов эритроцитов и их

прочности в

сдвиговом потоке. Так как, в соответствие с формулой Сиско,

характерный

размер агрегатов эритроцитов пропорционален показателю вязкости

крови,

наблюдений за кинетикой распада эритроцитарных агрегатов

достаточно для

оценки эффективной вязкости крови (k).

Оценки вязкости крови с помощью параметра k хорошо

согласуются с

оценками, получаемыми с помощью классических вискозиметрических

измерений.

Таким образом, использование параметра k позволяет

избежать

дополнительного тестирования образцов крови в вискозиметре,

существенно

облегчая экспериментальную процедуру комплексного

гемореологического

обследования.

6.4.2.2. Животные, оборудование и материалы

6.4.2.2.1. Животные

Мелкие лабораторные животные (крысы и мыши) линейные (крысы линий Wistar, Sprague-

Dawley и др.; мыши линий CBA, C57B1/6 и др.), так и нелинейные. В случае использования

линейных животных необходимо указать линию животных.

Количество животных в группе зависит от целей исследования, но не должно быть менее 10

особей в группе. Разброс по исходной массе тела животных в группе не должен превышать +/- 10%.

В течение всего эксперимента животные должны иметь свободный доступ к корму и питьевой воде

(за исключением времени измерения физиологических параметров). Для унификации исследований

животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион согласно МУ

1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

6.4.2.2.2. Оборудование

Автоматический коаксиально-цилиндрический лазерный агрегометр-деформометр "LADE"

("РеоМедЛаб", Россия; реологический зазор - 0,9 мм). Компьютер IBM PC-совместимый по ГОСТ

27201-87 с установленным программным обеспечением SPSS 12 (SPSS Inc., США). Микроскоп с 40-

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

кратным увеличением класса I по ГОСТ 12.2.007.0-75.

6.4.2.2.3. Материалы и реактивы

Одноразовые пластиковые пробирки по ТУ 64-2-30-80. Дозаторы пипеточные по ТУ 64-16-55-

90 с диапазоном объема доз 20 - 200 куб. мм, 200 - 1000 куб. мм и дискретностью установки доз 1 и 5

куб. мм, соответственно, с наконечниками.

Глицерин по ГОСТ 6824-96. Полиэтиленоксид Polyox WSR-301

(Union

Carbide, США; средняя молекулярная масса - 4 x 10).

6.4.2.3. Подготовка образцов крови

Образцы крови лабораторных крыс разделяют на несколько равных по

объему

проб для определения фоновых значений регистрируемых показателей, а

также

значений, получаемых после замещения части плазмы на коллоидный

раствор,

водную дисперсию наноматериала или контрольный 18% раствор

глицерина.

Тестирование осуществляют через 2 +/- 1 часа после забора крови и

через 2 -

5 минут после замещения плазмы при температуре 25 °C.

Используют

наноматериал в концентрациях от 1/100 до 1 IC.

Приготовление разбавленной (в 500 раз) суспензии производят с использованием 1,5% раствора

высокомолекулярного полиэтиленоксида для увеличения вязкости среды и, следовательно,

возможности более дифференцированного воздействия на клетки.

Кровь у мелких лабораторных животных (мыши, крысы) отбирают из хвоста или из сердца (в

случае вскрытия животных). Оптимальный объем сыворотки крови - не менее 30 куб. мм. Забор

крови производят в одноразовые пластиковые пробирки.

6.4.2.4. Проведение измерений

Форму эритроцитов контролируют под микроскопом с сорокакратным увеличением.

Микрореологические свойства эритроцитов исследуют оптическим методом с помощью

автоматического коаксиально-цилиндрического лазерного агрегометра-деформометра "LADE".

Анализируют исходные образцы крови (фоновые показатели), образцы крови с замещением

части плазмы на раствор глицерина (контрольные показатели) и на препарат тестируемого

наноматериала.

6.4.2.5. Анализ и интерпретация полученных данных

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Анализируют контуры дифракционной картины, соответствующие

контурам

эритроцита. Определяют индекс эллиптичности (IE) по

формуле:

IE = (L - H) / (L + H), где L - длина, H - ширина овала.

Регистрируют

-1 -1

зависимость IE от скорости сдвига (гамма; от ~ 3 с до ~ 1300 с).

Кривую

зависимости IE от (гамма) спрямляют в полулогарифмических

координатах,

то есть обрабатывают как экспоненту. Рассчитывают тангенс угла

наклона

прямой IE (ln(гамма)) - tg альфа, который является показателем

степени

изменения формы эритроцита при ступенчатом увеличении скорости

сдвига.

Максимально возможная деформация эритроцитов характеризуется

индексом

ID, который равен значению IE при максимальной скорости

сдвига

max

-1

(~ 2500 с).

Вязкость крови в целом оценивают на основании вышеописанных

измерений

гидродинамической прочности эритроцитарных агрегатов. Эффективную

вязкость

крови (k) оценивают на основании параметров, отражающих прочность и

размер

агрегатов эритроцитов в сдвиговом потоке. Эти измерения позволяют

оценить

динамику изменения размера агрегатов эритроцитов с изменением

скорости

сдвига.

Результаты измерений для опытной и контрольной групп фиксируются в виде таблицы:

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Таблица 7

Дата добавления: 2014-11-25