Лабораторных животных

Определения гематологических показателей

Тестирование безопасности наноматериалов на основе

6.4.1. Определение кинетики агрегации и дезагрегации эритроцитов

6.4.1.1. Принцип метода

Метод основан на том, что интенсивность обратного светорассеяния (I) пропорциональна

количеству центров рассеяния. По мере агрегации эритроцитов (объединения их в характерные

структуры, называемые "монетными столбиками"), количество центров рассеяния уменьшается и,

соответственно, значение I снижается. В случае, когда агрегация эритроцитов в суспензии не

происходит (количество центров рассеяния максимально), I принимает максимальное значение.

Таким образом, данный метод позволяет оценивать усредненную динамику спонтанной агрегации-

дезагрегации эритроцитов.

6.4.1.2. Животные, оборудование и материалы

6.4.1.2.1. Животные

Мелкие лабораторные животные (крысы и мыши) линейные (крысы линий Wistar, Sprague-

Dawley и др.; мыши линий CBA, C57B1/6 и др.), так и нелинейные. В случае использования

линейных животных необходимо указать линию животных.

Количество животных в группе зависит от целей исследования, но не должно быть менее 10

особей в группе. Разброс по исходной массе тела животных в группе не должен превышать +/- 10%.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

В течение всего эксперимента животные должны иметь свободный доступ к корму и питьевой воде

(за исключением времени измерения физиологических параметров). Для унификации исследований

животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион согласно МУ

1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

6.4.1.2.2. Оборудование

Автоматический коаксиально-цилиндрический лазерный агрегометр-деформометр "LADE"

("РеоМедЛаб", Россия; реологический зазор - 0,9 мм). Компьютер IBM PC-совместимый по ГОСТ

27201-87 с установленным программным обеспечением Powergraph (ООО "ДИСофт", Россия), SPSS

12 (SPSS Inc., США).

6.4.1.2.3. Материалы и реактивы

Одноразовые пластиковые пробирки по ТУ 64-2-30-80. Дозаторы пипеточные по ТУ 64-16-55-

90 с диапазоном объема доз 20 - 200 куб. мм и 200 - 1000 куб. мм и дискретности установки доз 1 и 5

куб. мм (соответственно) с наконечниками.

Глицерин по ГОСТ 6824-96.

6.4.1.3. Метод введения наноматериалов животным

Образцы крови лабораторных крыс разделить на несколько равных по

объему

проб для определения фоновых значений регистрируемых показателей, а

также

значений, получаемых после замещения части плазмы на коллоидный

раствор,

водную дисперсию наноматериала или контрольный 18% раствор

глицерина.

Тестирование осуществляют через 2 +/- 1 часа после забора крови и

через 2 -

5 минут после замещения плазмы при температуре 25 °C.

Используют

наноматериал в концентрациях от 1/100 до 1 IC.

6.4.1.4. Проведение измерений

Кровь у мелких лабораторных животных (мыши, крысы) можно отбирать из хвоста или из

сердца (в случае вскрытия животных). Оптимальный объем сыворотки крови - не менее 30 куб. мм.

Забор крови производят в одноразовые пластиковые пробирки.

Реологические свойства эритроцитов изучают оптическим методом с помощью автоматического

коаксиально-цилиндрического лазерного агрегометра-деформометра.

Кинетику агрегации и дезагрегации эритроцитов исследуют путем измерения интенсивности

обратного светорассеяния (I) в пробе крови с гематокритным показателем (Ht), равным 40% (часть

объема крови, приходящаяся на форменные элементы, в %).

Спонтанную агрегацию (a) эритроцитов изучают после остановки

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

потока

крови путем регистрации изменения I со временем (t).

a

Процесс дезагрегации (d) (распада эритроцитарных агрегатов)

исследуют в

условиях сдвигового потока. Для этого по окончании процесса

агрегации

-1 -1

пошагово увеличивают скорость сдвига от ~ 2 с до ~ 130 с и

регистрируют

зависимость величины I от скорости сдвига (гамма).

d

Зависимости I (t) и I (гамма) регистрируют в исходных образцах

крови

a d

(фоновые показатели), в образцах крови с замещением части плазмы на

раствор

глицерина (контрольные показатели) и на препарат

тестируемого

наноматериала.

6.4.1.5. Анализ и интерпретация полученных данных

Спонтанная агрегация. Начальную, экспоненциальную часть

кривой

зависимости I от t спрямляют в полулогарифмических координатах.

Определяют

a

характерное время образования "монетных столбиков" (T), как

тангенс угла

наклона прямой ln I (t), т.е., с помощью отношения T = t / ln I.

a a

Для того, чтобы охарактеризовать время процесса агрегации

эритроцитов в

целом, зависимость I (t) аппроксимируют гиперболой. Спрямление кривой

I (t)

a a

при этом производят в полуобратных координатах.

Параметр kT,

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

характеризующий время процесса агрегации в целом, находят как

тангенс угла

наклона прямой 1 / I (t).

a

Разность между начальным и конечным значениями I - (A), так

называемая

a

"амплитуда" кривой I (t), является показателем того, насколько

сильно

a

уменьшилось количество центров рассеяния, т.е. отражает степень

агрегации

эритроцитов и является величиной, характеризующей размер

эритроцитарных

агрегатов.

Процесс дезагрегации. Полученную существенно нелинейную

кривую

зависимости I от скорости сдвига (гамма) спрямляют в

полулогарифмических

d

координатах. Показателем гидродинамической прочности основной

массы

агрегатов служит параметр бета, вычисляемый по формуле

бета =

гамма / ln(I).

d

Оценку прочности особо крупных агрегатов осуществляют с

помощью

I - I

0 2,5

параметра I = --------- x 100% (где I - разность между

исходным

2,5 I 0

значением I, в условиях максимальной агрегации эритроцитов, и

конечным I,

d d

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

характеризующим конечный результат дезагрегации эритроцитов в

сдвиговом

потоке, а I - интенсивность обратного светорассеяния,

соответствующая

2,5

-1

скорости сдвига 2,5 с). Чем меньше прочность агрегатов, тем

большая их

доля распадается при минимальной скорости сдвига, тем больше значение

I.

2,5

Таким образом, I отражает процент эритроцитарных агрегатов,

способных

2,5

распасться при минимальной скорости сдвига.

Результаты измерений для опытной и контрольной проб фиксируют в виде таблицы:

Таблица 6

Дата добавления: 2014-11-25