Сердечно-сосудистой системы

Методики измерения функций

6.3.1. Тестирование безопасности наноматериалов на инвазивной модели тромбогенеза

6.3.1.1. Принцип метода

Данный метод позволяет оценить влияние наноматериалов на процесс тромбообразования,

изменение его скорости и величину тромба. Лабораторному животному внутривенно вводят

краситель, затем хирургически выделяют правую бедренную вену и вызывают ее мягкое

эндотелиальное повреждение. После этого наблюдают образование/исчезновение тромба под

микроскопом.

6.3.1.2. Животные, оборудование и материалы

6.3.1.2.1. Животные

Мелкие лабораторные животные (крысы и мыши) линейные (крысы линий Wistar, Sprague-

Dawley и др.; мыши линий CBA, C57B1/6 и др.), так и нелинейные. В случае использования

линейных животных необходимо указать линию животных.

Количество животных в группе зависит от целей исследования, но не должно быть менее 10

особей в группе. Разброс по исходной массе тела животных в группе не должен превышать +/- 10%.

В течение всего эксперимента животные должны иметь свободный доступ к корму и питьевой воде

(за исключением времени измерения физиологических параметров). Для унификации исследований

животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион согласно МУ

1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

6.3.1.2.2. Оборудование

Трансиллюминатор CTS 20L (UVItec Ltd, Англия). Нагревательный столик ML-1.5-4 (ООО

Мила-Форм, Россия, или аналогичный). Микроскоп стереоскопический МС-2 ZOOM вар. 1TD-1

бинокуляр, рабочее расстояние 85 мм, универсальный штатив (BANDEQ, Китай) или аналогичный.

Компрессорный (струйный) небулайзер Comp AIR Pro (NE-C29-E) (Omron, Япония). Клетки для

содержания животных "плексигласовый домик" (ООО "СПИ", Россия, или аналогичный).

Затравочная камера. Компьютер IBM PC-совместимый по ГОСТ 27201-87. Обработка

экспериментальных данных проводится с помощью программного обеспечения SPSS 12.

6.3.1.2.3. Материалы и реактивы

Полиэтиленовые катетеры 2-F (Balton, Польша) или аналогичные. Хирургические инструменты

ГОСТ 19126-79 (ПТО Медтехника, Россия) или аналогичные: хирургические ножницы по ГОСТ

21239-89, ножницы глазные по ТУ 64-1-64-78, пинцет по ГОСТ 21241-89, пинцет анатомический

глазной прямой ПА 100 x 0.6 ТУ 64-1-3264-81Е, крючки хирургические ручные ТУ 64-1-3317-79

(ГНПП "Мединструмент", Россия). Иглы хирургические для сшивания кожи, мышц, сухожилий

типоразмеры от 1B1-0.5 x 12 до 1B1-1.5 x 85 ТУ 64-1-3798-84Е, зонд - игла трупная 1B2 18 x 108

(ГНПП "Мединструмент", Россия, ПТО "Медтехника", АО "Казанский МИЗ") или аналогичные. Нити

хирургические лавсановые "Абактолат-Л", условных номеров 5/0; 4/0; 3/0; 2/0 (ООО "Волоть", Россия).

Одноразовые пластиковые шприцы по ГОСТ 24861-91. Чашки Петри по ГОСТ 25336-82.

Бенгальский Розовый натриевая соль R3877 (Sigma-Aldrich, США). Этаминал натриевая соль

P3761 (Sigma-Aldrich, США). Физиологический раствор, приготовленный по ГОСТ 10444.1. Гепарин

9041-08-1 (Sigma, США), сульфаниламид (стрептоцид) порошок (Нижфарм, Россия).

6.3.1.3. Метод введения наноматериалов животным

Рекомендуется острое внутривенное введение наноматериала

(однократная

инъекция) за 24 часа до проведения операции в дозах от

минимальной

токсической дозы до 1 LD (при возможности ее определения). Возможно

также

острое ингаляционное введение (однократная ингаляция в течение 1 часа

за 24

часа до проведения операции в дозах от минимальной токсической

дозы до

1 LD (при возможности ее определения). При ингаляционном способе

введения

крысу помещают в затравочную камеру, в которой при помощи

небулайзера

распыляют наноматериал.

Контрольным животным вводят физиологический раствор в том же объеме и тем же способом,

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

что и коллоидный раствор или дисперсию наноматериала.

6.3.1.4. Проведение измерений

Растворы фармакологических веществ в организм животного вводят через катетер,

имплантированный в яремную вену. Операцию по вживлению катетеров проводят за сутки или двое

до опыта.

Имплантация катетеров. Перед операцией катетер заполняют физиологическим раствором,

содержащим гепарин (500 ед./куб. см) так, чтобы в нем не осталось пузырьков воздуха, широкий

конец катетера плотно затыкают.

Животное анестезируют с помощью этаминал-натриевого наркоза (40 мг/кг, вводят

внутрибрюшинно) и располагают брюшной стороной вверх на нагревательном столике, нагретом до

температуры 37 °C. Над правой ключицей удаляют шерсть и делают разрез кожи длиной 0,5 см.

Жировую ткань раздвигают пинцетами и крючками. Правую яремную вену отделяют от окружающих

тканей на участке 5 - 6 мм и подводят под нее две лигатуры (шовные нити). Затем под вену подводят

бранши глазного пинцета так, чтобы пинцет пережимал вену, но не растягивал ее. Одну из лигатур,

расположенную дальше от сердца, плотно завязывают. На расстоянии 1 - 2 мм от завязанной

лигатуры стенку вены надрезают и вводят через разрез кончик катетера. Вторую лигатуру завязывают

на один узел, чтобы она слегка придерживала кончик катетера и не давала вытекать крови (после

того, как из-под вены будет вынут пинцет). Затем вынимают пинцет и продвигают катетер на 2 - 2,5

см по направлению к сердцу. Фиксирующую лигатуру затягивают туже, после чего завязывают на ней

второй узел. Рядом накладывают еще одну лигатуру.

После имплантации катетера животное переворачивают на брюшную сторону, удаляют шерсть

в межлопаточной области и делают разрез кожи длиной 2 - 3 мм. Периферический конец катетера

протаскивают под кожей с помощью зонда и выводят в кожный разрез. Разрез над ключицей

зашивают прерывистым швом, а разрез в межлопаточной области - кисетным швом. Швы

обрабатывают стрептоцидом.

После операции животных содержат в индивидуальных клетках (30 x 30 x 30 см) при свободном

доступе к пище и воде.

Инвазивная модель тромбогенеза. Через 24 ч после введения наноматериала животному через

катетер, вживленный в яремную вену, вводят Бенгальский Розовый (в дозе). Затем хирургическим

путем выделяют правую бедренную вену и помещают ее в чашку Петри, заполненную

физиологическим раствором. Путем надавливания на вену вызывают мягкое эндотелиальное

повреждение бедренной вены. Чашку Петри с исследуемым образцом помещают на

трансиллюминатор и в течение 40 мин. наблюдают образование/исчезновение тромба с помощью

бинокуляров с 40-кратным увеличением.

6.3.1.5. Анализ и интерпретация полученных данных

Размер тромба выражают в условных единицах как общую площадь под кривой изменения

размера тромба через 24 ч после воздействия введенного наноматериала.

Статистический анализ данных проводят, как указано в п. 6.2.1.5.

Расчет

LD и минимальной токсической дозы производится при предварительной

оценке

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

острой токсичности наноматериала согласно МУ

1.2.2520-09

"Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

Наноматериал признается безопасным по результатам тестирования, если размер тромба,

скорость образования тромба и скорость исчезновения тромба у животных, подвергшихся

воздействию наноматериала, не отличается достоверно по этим параметрам от животных в

контрольной группе.

6.3.2. Методика электроплетизмографического измерения артериального давления в хвостовой

артерии

6.3.2.1. Принцип метода

Электроплетизмографическое измерение артериального давления (АД) в хвостовой артерии

("tail-cuff) основано на том же принципе, что и измерение артериального давления у человека по

способу Рива-Роччи. Просвет крупной артерии пережимается манжетой и во время постепенного

снижения давления воздуха в манжете отмечается уровень давления, при котором кровь начинает

проталкиваться через сдавленную область. Этот уровень соответствует систолическому АД. У

человека уровень систолического АД детектируется аускультативно (по появлению тонов Короткова).

У крыс наиболее часто используют специальные устройства, регистрирующие изменения окружности

хвоста при поступлении порций крови. Важным достоинством данного метода служит его

неинвазивность: он позволяет многократно измерять АД у одного и того же животного в ходе

длительного хронического эксперимента.

6.3.2.2. Животные, оборудование и материалы

6.3.2.2.1. Животные

Нелинейные и линейные крысы (линий Wistar, Sprague-Dawley и др.). В случае использования

линейных крыс необходимо указать линию.

Количество животных в группе зависит от целей исследования, но не должно быть менее 10

особей. Разброс по исходной массе тела животных в группе не должен превышать +/- 10%. В течение

всего эксперимента животные должны иметь свободный доступ к корму и питьевой воде (за

исключением времени измерения физиологических параметров). Для унификации исследований

животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион согласно МУ

1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

6.3.2.2.2. Оборудование

Система неинвазивного измерения кровяного давления и параметров сердечно-сосудистой

системы у грызунов (ООО "СПИ", Россия, или аналогичная). В состав входит тонометр (для

определения артериального давления у человека), хвостовая манжета, нагреватель, сканер и

контейнер для животного. Прибор основан на регулируемом пневмоприводе, в котором текущее

значение давления, полученное датчиком давления, отображается на цифровом дисплее по мере

получения.

В качестве альтернативы система неинвазивного измерения кровяного давления может быть

собрана из отдельных элементов. Электроманометрический датчик давления P23ID (Gould Statham

Instruments, США) или аналогичный (частота опроса сигнала давления должна быть не менее 250 -

500 Гц). Усилитель потенциалов по ГОСТ 26033-91 для выходного сигнала до 10 В и имеющий

полосу частот от 10 Гц до 20 кГц. Аналого-цифровой преобразователь Е14-440 (L-Card, Россия,

внесен в Государственный реестр средств измерения под N 28131-04) или аналогичный (разрядность

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

АЦП - 14 бит, максимальная частота преобразования - 400 кГц, диапазон входного сигнала: +/- 10 В;

+/- 2,5 В; +/- 0,625 В; +/- 0,156 В). Манометр и резиновая груша входят в состав механического

тонометра, предназначенного для измерения давления у человека, модель AnD UA-100 (A&D,

Япония), BP AG 1-10 (Microlife AG, Швейцария) или аналогичный.

Нагревательный столик ML-1.5-4 (ООО Мила-Форм, Россия, или аналогичный). Клетки для

содержания животных, "плексигласовый домик" (ООО "СПИ", Россия, или аналогичный).

Компьютер IBM PC-совместимый по ГОСТ 27201-87 с установленным программным

обеспечением Powergraph (ООО "ДИСофт", Россия,), MatLab (MathWorks, США) и SPSS 12.

6.3.2.2.3. Материалы и реактивы

Манжета, надетая на хвост крысы; стеклянная колба по ГОСТ 10394-74, герметично закрытая

пробкой (буферная емкость).

Физиологический раствор, приготовленный по ГОСТ 10444.1.

6.3.2.3. Метод введения наноматериалов животным

Наноматериалы можно вводить: парентерально (внутривенно, внутримышечно,

внутрибрюшинно), ингаляционно и перорально (в составе корма, питьевой воды или через зонд).

Допустимо острое (однократное введение), подострое (ежедневное введение в течение 1 - 3 месяцев)

и хроническое введение (ежедневное введение в течение 6 месяцев и более) наноматериала.

Доза вводимого наноматериала при остром воздействии может

варьировать

от минимальной токсической до 1 LD (при возможности ее

определения), при

подостром воздействии - от минимальной токсической до 1/5 LD

, при

хроническом воздействии - 1/3 - 1/10 части минимальной токсической

дозы.

Контрольным животным вводят физиологический раствор в том же объеме

и тем

же способом, что и коллоидный раствор или дисперсию наноматериала.

6.3.2.4. Проведение измерений

При измерении АД животные подвергаются умеренному стрессированию, что сказывается на

уровне АД. В связи с этим в течение 2 - 3 предшествующих эксперименту недель крыс необходимо

приучать к процедуре измерения.

Электроплетизмографическое измерение артериального давления проводят:

1) в режиме экспозиции, т.е. во время или непосредственно после введения наноматериала;

2) ежедневно в течение 14 дней после введения наноматериала (при остром введении), на 7, 14,

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

28, 56 и 84 дни (при подостром введении), на 210, 240, 270, 300, 330 и 360 дни (при хроническом

введении).

Принципиальная схема экспериментальной установки для измерения АД в хвостовой артерии

крысы изображена на рисунке 1 (здесь и далее рисунки не приводятся).

Поскольку при комнатной температуре скорость кровотока в хвостовой артерии крысы

настолько низкая, что измерение АД невозможно, животное помещают в плексигласовый домик,

расположенный на подогреваемом столике, нагретом до температуры 37 °C. На основание хвоста

надевают манжету, которую через буферную емкость соединяют с манометром и с резиновой грушей.

С помощью манометра измеряют давление воздуха в манжете. Дистально от манжеты располагают

датчик, регистрирующий изменение окружности хвоста при прохождении пульсовой волны. Датчик

представляет собой резиновую трубку, заполненную графитовым порошком.

В манжету нагнетают воздух до давления, при котором полностью прекращается кровоток в

хвостовой артерии. Затем давление воздуха в манжете медленно снижают и отмечают уровень

давления, при котором появляются пульсации крови, в соответствии с рисунком 2. Это значение

давления в манжете соответствует систолическому артериальному давлению животного. Сигнал от

датчика усиливается с помощью усилителя с последующей регистрацией на компьютере с помощью

аналого-цифрового преобразователя и соответствующего программного обеспечения.

6.3.2.5. Анализ и интерпретация полученных данных

В день регистрации для каждого животного проводят, как минимум, три измерения АД;

полученные значения усредняют.

Статистический анализ данных проводят, как указано в п. 6.2.1.5.

Данные

представляют в виде среднего арифметического +/- стандартное

отклонение

(SD). Расчет LD и минимальной токсической дозы

производится при

предварительной оценке острой токсичности наноматериала

согласно

МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка

безопасности

наноматериалов".

Наноматериал признается безопасным по результатам тестирования, если показатель среднего

артериального давления остается в пределах физиологической нормы для крыс (90 - 110 мм рт. ст.).

6.3.3. Методика регистрации АД с использованием имплантируемых катетеров

6.3.3.1. Принцип метода

Методика регистрации артериального давления (АД) через внутриартериальный катетер

("прямой" метод) позволяет измерять АД и частоту сердечных сокращений (ЧСС) непрерывно, что

дает возможность вычислять величины, характеризующие вариабельность параметров

гемодинамики. Этот метод практически не вызывает стрессирования животных в условиях

адекватной экспериментальной обстановки: измерения необходимо проводить в тихом и

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

затемненном помещении. После завершения подготовительных процедур следует адаптировать крысу

к условиям эксперимента.

Модификацией метода является методика оценки влияния наноматериалов на изменения

артериального давления и частоты сердцебиения при стрессе. Очень информативна модель, в

которой стресс возникает под воздействием струи воздуха ("air-jet stress"). В этой модели у крыс

возникает ориентировочная реакция, сопровождающаяся умеренным повышением АД и ЧСС, а

также характерным перераспределением кровотока между органами.

Другой модификацией метода является методика

тестирования

чувствительности кардиохронотропного компонента

барорефлекса. При

определении сердечного хронотропного компонента барорефлекса

регистрируют

изменения частоты сердцебиений, возникающие при введении

фармакологических

веществ, вызывающих умеренное повышение или снижение

артериального

давления. В качестве тест-препаратов, как правило, используют

фенилэфрин,

который суживает кровеносные сосуды, взаимодействуя с

альфа -

адренорецепторами, и нитропруссид натрия, который является донором

оксида

азота, расслабляющего гладкую мускулатуру сосудов. Эти вещества

вызывают

кратковременные изменения артериального давления. В дозах,

используемых для

тестирования чувствительности барорефлекса, нитропруссид

натрия и

фенилэфрин не оказывают прямого действия на сердце, так что

наблюдаемые

изменения частоты сердцебиений имеют почти исключительно

нейрогенную

рефлекторную природу. После хирургической денервации

барорецепторов,

блокирования проведения возбуждения в ганглиях автономной нервной

системы

или при блокаде симпатических и парасимпатических влияний на

сердце

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

изменения давления в ответ на введение тест-препаратов не

сопровождаются

изменениями сердечного ритма.

6.3.3.2. Животные, оборудование и материалы

6.3.3.2.1. Животные

Нелинейные и линейные крысы (линий Wistar, Sprague-Dawley и др.). В случае использования

линейных крыс необходимо указать линию.

Количество животных в группе зависит от целей исследования, но не должно быть менее 10

особей. Разброс по исходной массе тела животных в группе не должен превышать +/- 10%. В течение

всего эксперимента животные должны иметь свободный доступ к корму и питьевой воде (за

исключением времени измерения физиологических параметров). Для унификации исследований

животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион согласно МУ

1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов".

6.3.3.2.2. Оборудование

Электроманометрический датчик давления P23ID (Gould Statham Instruments, США) или

аналогичный. Частота опроса сигнала давления должна быть не менее 250 - 500 Гц. Усилитель

потенциалов по ГОСТ 26033-91 для выходного сигнала до 10 В и имеющий полосу частот от 10 Гц

до 20 кГц. Аналого-цифровой преобразователь Е14-440 (L-Card, Россия, внесен в Государственный

реестр средств измерения под N 28131-04) или аналогичный (разрядность АЦП - 14 бит,

максимальная частота преобразования - 400 кГц, диапазон входного сигнала: +/- 10 В; +/- 2,5 В; +/-

0,625 В; +/- 0,156 В). Манометр и резиновая груша входят в состав механического тонометра,

предназначенного для измерения давления у человека, модель AnD UA-100 (A&D, Япония), BP AG1-

10 (Microlife AG, Швейцария), или аналогичный.

Компьютер IBM PC-совместимый по ГОСТ 27201-87 с установленным программным

обеспечением Powergraph (ООО "ДИСофт", Россия), MatLab (MathWorks, США) и SPSS 12 (SPSS Inc.,

США) или с аналогичными параметрами.

Нагревательный столик ML-1.5-4 (ООО Мила-Форм, Россия, или аналогичный). Клетки для

содержания животных, "плексигласовый домик" (ООО "СПИ", Россия, или аналогичный).

Баллон со сжатым воздухом 5 литров ГОСТ 949-73 (пневматический нанос). Стеклянная колба

по ГОСТ 10394-74, герметично закрытая пробкой (буферная емкость), камера, инфузор для промывки

катетера и два крана.

6.3.3.2.3. Материалы и реактивы

Полиэтиленовые трубки PE-10 (Portex, Великобритания), PE-50 (Portex, Великобритания) или

аналогичные (толстая - наружный диаметр ~ 1 мм, внутренний диаметр ~ 0,6 мм и тонкая -

наружный диаметр ~ 0,6 мм, внутренний диаметр ~ 0,3 мм). Трубка пластиковая (поливинилхлорид)

с внутренним диаметром 7 мм (ВТМ-2000, Россия). Стальная проволока общего назначения ГОСТ

3282-74 диаметр от 0,2 мм (Мегапром, Россия). Горелка газовая Phoenix (Schuett, Германия).

Хирургические инструменты ГОСТ 19126-79 (ГНПП "Мединструмент", Россия): хирургические

ножницы по ГОСТ 21239-89, ножницы глазные по ТУ 64-1-64-78, пинцет по ГОСТ 21241-89,

пинцет анатомический глазной прямой ПА 100 x 0.6 ТУ 64-1-3264-81Е, крючки хирургические

ручные ТУ 64-1-3317-79. Зонд - игла трупная 1B2 18 x 108, иглы хирургические для сшивания кожи,

мышц и сухожилий (типоразмеры от 1B1-0.5 x 12 до 1B1-1.5 x 85) ТУ 64-1-3798-84Е (ГНПП

"Мединструмент", Россия, ПТО "Медтехника", АО "Казанский МИЗ") или аналогичные. Нити

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

хирургические лавсановые "Абактолат-Л", условных номеров 5/0; 4/0; 3/0; 2/0 (ООО "Волоть", Россия).

Этаминал натриевая соль P3761 (Sigma-Aldrich, США). Физиологический раствор,

приготовленный по ГОСТ 10444.1. Гепарин 9041-08-1 (Sigma, США), сульфаниламид (стрептоцид)

порошок (Нижфарм, Россия), нитропруссид натрия 71778 (Sigma, США), фенилэфрин Р6126 (Sigma,

США).

6.3.3.3. Метод введения наноматериалов животным

Рекомендуется проводить острое (однократное) введение наноматериала, т.к. регистрация АД

данным методом может проводиться в течение не более 7 дней. Возможно также подострое

(ежедневное в течение 1 - 3 месяцев) и хроническое (ежедневное в течение 6 месяцев и более)

введение наноматериала. В этих случаях регистрацию АД проводят однократно на определенном

сроке. При остром воздействии введение наноматериала проводят после имплантации катетеров,

при подостром и хроническом воздействии введение наноматериала проводят за 1 час до

имплантации катетеров. При остром введении измерения АД означенным методом проводят сначала

в режиме экспозиции, т.е. во время и непосредственно после введения наноматериала, а затем

каждый день в течение 7 дней (или пока существует возможность регистрации). При подостром и

хроническом введении наноматериала измерение АД проводят на 10, 30, 60 и 90 сут. и на 30 и 180

сут. и более, соответственно.

Доза вводимого наноматериала при остром воздействии может

варьировать

от минимальной токсической до 1 LD (при возможности ее

определения), при

подостром воздействии - от минимальной токсической до 1/5 LD

, при

хроническом воздействии - 1/3 - 1/10 части минимальной токсической

дозы.

В случае внутривенного введения коллоидный раствор или водную дисперсию наноматериала

вводят через тонкую трубочку длиной 50 - 60 см, которая соединена с катетером в яремной или

бедренной вене. В этом случае крыса не видит манипуляций экспериментатора. Суммарный объем

катетера и трубки не должен превышать 100 куб. мм.

Контрольным животным вводят физиологический раствор в том же объеме и тем же способом,

что и коллоидный раствор или дисперсию наноматериала.

6.3.3.4. Проведение измерений

6.3.3.4.1. Подготовка к регистрации АД. Изготовление и имплантация катетеров

Операцию по вживлению катетеров проводят за сутки или двое до опыта под наркозом.

Катетер, служащий для регистрации АД, вводят в бедренную артерию. Растворы фармакологических

веществ в организм крысы вводят через катетер, имплантированный либо в бедренную, либо в

яремную вену. В экспериментах с введением нескольких препаратов крысе имплантируют несколько

венозных катетеров или же используют 2-канальные катетеры.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Катетеры изготавливают из полиэтиленовых трубок: толстой PE-50 (наружный диаметр ~ 1 мм,

внутренний диаметр ~ 0,6 мм) и более тонкой PE-10 (наружный диаметр ~ 0,6 мм, внутренний

диаметр ~ 0,3 мм). Для соединения двух трубок их надевают на металлическую проволоку, место

стыка нагревают в струе горячего воздуха от газовой горелки, а затем осторожно сдвигают трубки по

направлению друг к другу. Поскольку полиэтилен при нагревании плавится, концы трубок

"слипаются", и получается герметичное соединение. Внешний вид катетеров приведен на рисунке 3.

Их размеры зависят от размеров крысы. На катетерах, имплантируемых в бедренную артерию и в

бедренную вену, делают спираль, которая предотвращает пережатие трубок при движении

животного. Чтобы сделать спираль, трубку обматывают вокруг металлического предмета, погружают

на 5 - 10 сек. в кипящую воду, а затем быстро охлаждают.

Перед операцией катетер заполняют физиологическим раствором, содержащим гепарин (500

ед./куб. см) так, чтобы в нем не осталось пузырьков воздуха, широкий конец катетера плотно

затыкают.

Животное анестезируют с помощью этаминал-натриевого наркоза (40 мг/кг, вводят

внутрибрюшинно) и располагают брюшной стороной вверх на нагревательном столике, нагретом до

температуры 37 °C. Операцию начинают с катетеризации яремной вены. Над правой ключицей

удаляют шерсть и делают разрез кожи длиной 0,5 см. Жировую ткань раздвигают пинцетами и

крючками. Правую яремную вену отделяют от окружающих тканей на участке 5 - 6 мм и подводят под

нее две лигатуры (шовные нити). Затем под вену подводят бранши глазного пинцета так, чтобы

пинцет пережимал вену, но не растягивал ее. Одну из лигатур, расположенную дальше от сердца,

плотно завязывают. На расстоянии 1 - 2 мм от завязанной лигатуры стенку вены надрезают и вводят

через разрез кончик катетера. Вторую лигатуру завязывают на один узел, чтобы она слегка

придерживала кончик катетера и не давала вытекать крови (после того, как из-под вены будет вынут

пинцет). Затем вынимают пинцет и продвигают катетер на 2 - 2,5 см по направлению к сердцу.

Фиксирующую лигатуру затягивают туже, после чего завязывают на ней второй узел. Рядом

накладывают еще одну лигатуру.

Затем приступают к катетеризации сосудов, расположенных на бедре. На внутренней стороне

бедра удаляют шерсть, затем делают разрез кожи длиной 5 - 6 мм (разрез следует делать над самым

началом бедренной артерии). Раздвигают жировую ткань и находят нервно-сосудистый пучок,

состоящий из бедренной вены, бедренной артерии и бедренного нерва. Из пучка осторожно

выделяют артерию и вену и подводят под них лигатуры. Сначала проводят катетеризацию вены,

затем - артерии. В бедренную вену катетер вставляют так же, как в яремную, за исключением того,

что кончик катетера продвигают на большее расстояние (до спирали).

Основные этапы вставления катетера в артерию такие же, как в вену, однако следует помнить,

что артериальное давление значительно выше венозного, что может привести к большой

кровопотере. Перед разрезанием стенки сосуда необходимо убедиться, что подведенный под артерию

пинцет хорошо пережимает ее. После вставления катетера вынимать пинцет следует осторожно, в

месте наложения лигатуры кончик катетера в сосуде придерживают пинцетом. Этот катетер также

продвигают по сосуду до спирали.

После имплантации всех катетеров животное переворачивают на брюшную сторону, удаляют

шерсть в межлопаточной области и делают разрез кожи длиной 2 - 3 мм. Периферические концы

катетеров протаскивают под кожей с помощью зонда и выводят в кожный разрез. Разрез над

ключицей зашивают прерывистым швом, а разрез в межлопаточной области - кисетным швом. Швы

обрабатывают стрептоцидом.

После операции животных содержат в индивидуальных клетках (30 x 30 x 30 см) при свободном

доступе к пище и воде.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

6.3.3.4.2. Регистрация сигнала артериального давления

Установка для регистрации давления крови прямым способом изображена на рисунке 4. Она

состоит из электроманометрического датчика давления, который преобразует механические

колебания давления в электрические сигналы; усилителя потенциалов и компьютера типа IBM PC со

встроенным аналого-цифровым преобразователем (АЦП). Требования к усилителю определяются

типом АЦП, используемым для регистрации. Например, можно использовать 12-разрядный АЦП,

позволяющий оцифровывать сигналы с амплитудой до 5 В. Регистрацию и обработку

экспериментальных данных проводят с помощью специализированного программного обеспечения.

Частота опроса сигнала давления должна быть не менее 250 - 500 Гц.

Для калибровки датчика используют систему, которая состоит из буферной емкости, резиновой

груши, с помощью которой в этой емкости нагнетают давление, и манометра для измерения

давления. В систему крыса - датчик - буферная емкость встроены два крана (на рисунке 5 они

обозначены буквами А и Б). Когда датчик работает в режиме регистрации артериального давления,

кран А должен быть открыт, а кран Б - закрыт. Во время калибровки положение кранов обратное:

закрыт кран А и открыт кран Б.

В течение всего эксперимента для предотвращения тромбообразования катетер в бедренной

артерии непрерывно промывают гепаринизированным физиологическим раствором (50 ед./куб. см)

со скоростью 0,2 куб. см/час. Такая инфузия не влияет на уровень артериального давления, но

позволяет в течение длительного времени регистрировать стабильный сигнал.

Эксперимент должен проводиться в тихой затемненной комнате. После присоединения

катетеров к датчику давления и инфузионным трубкам в течение часа крысу адаптируют к условиям

эксперимента, при этом она успокаивается, и параметры гемодинамики стабилизируются. В течение

всего эксперимента животное может свободно перемещаться по клетке и имеет свободный доступ к

пище и воде. Одновременная регистрация параметров гемодинамики и поведения животных

показало, что в таких условиях проведения эксперимента преобладает "пассивное поведение"

животных (80 - 85% времени), длительность "активных форм поведения" (локомоции, груминг,

потребление воды и пищи) значительно меньше.

6.3.3.4.3. Методики оценки влияния наноматериалов на изменения артериального давления и

частоты сердцебиений при стрессе

Стресс моделируют струей воздуха, которая подается через трубку, помещенную в угол клетки,

как показано на рисунке 5.

Внутренний диаметр трубки составляет 7 мм, отверстие трубки должно находиться на высоте 4

см от пола клетки. Воздух в трубку нагнетается при помощи пневматического насоса, в качестве

которого может выступать баллон со сжатым воздухом. Мощность потока воздуха подбирают так,

чтобы он производил легкое шипение.

Длительность стрессирующего воздействия составляет 1 - 5 мин., в зависимости от

поставленной задачи. При коротком воздействии реакцию на стресс можно воспроизводить

многократно в течение одного эксперимента.

6.3.3.4.4. Методика тестирования чувствительности кардиохронотропного компонента

барорефлекса

Для тестирования чувствительности кардиохронотропного компонента барорефлекса вводят

фенилэфрин в дозе 2 мкг/кг, или нитропруссид натрия - в дозе 10 мкг/кг через тонкую трубочку

длиной 50 - 60 см, соединенную с катетером в яремной или бедренной вене. В этом случае крыса не

видит манипуляций экспериментатора. Суммарный объем катетера и трубки не должен превышать

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

100 куб. мм.

Изменения артериального давления при введении тест-препаратов должны быть достаточно

заметными (не менее 20 мм рт. ст.), но не превышать 40 мм рт. ст. Если эффекты слишком большие

или слишком маленькие, вводимые дозы тест-препаратов следует изменить. Во время введения тест-

препаратов крыса должна быть спокойной (если она ходит по клетке, умывается, ест или пьет -

подождать, пока не успокоится).

Примеры записей АД и длительности пульсового интервала представлены на рисунке 6.

6.3.3.5. Анализ и интерпретация полученных данных

6.3.3.5.1. Обработка результатов оценки влияния наноматериалов на параметры гемодинамики

и их вариабельности у бодрствующих крыс

Принцип методик анализа

Для оценки влияния наноматериалов используют методики оценки вариабельности параметров

гемодинамики. Во-первых, динамические характеристики параметров во многих случаях более

адекватно отражают эффективность работы регуляторных механизмов, чем статические, то есть

являются более информативными. Например, регистрация динамики системного артериального

давления позволяет выявить нарушение функционирования барорефлекса даже при неизменном

среднем уровне давления. Во-вторых, повышение вариабельности системного артериального

давления, характерное для многих заболеваний сердечно-сосудистой системы, усугубляет

гипертрофию стенки артериальных сосудов, провоцирует атеросклеротическое поражение сосудов и

нарушения микроциркуляции.

Вариабельность параметров гемодинамики можно оценивать:

- путем вычисления статистических характеристик - при анализе "суммарной" вариабельности

параметров;

- с использованием метода спектрального анализа - для определения колебаний параметров

гемодинамики, характеризующихся разными частотами; спектральный анализ используют при оценке

вариабельности гемодинамических показателей в стационарном состоянии;

- с использованием метода вэйвлет-анализа - для определения изменений вариабельности в

различных частотных диапазонах во время переходных процессов (например, при переходе от

спокойного состояния организма к условиям стресса).

Известно, что колебания АД, характеризующиеся разными частотами, имеют различное

происхождение. Традиционно различают высокочастотные, среднечастотные и низкочастотные

колебания; иногда их обозначают, соответственно, как очень низкочастотные, низкочастные и

высокочастотные.

Высокочастотные колебания АД (волны 2-го порядка) синхронны с дыхательными движениями,

у крыс их частота в среднем равна 1 Гц. Такие колебания возникают в результате регулярных

изменений давления в грудной полости, которые могут непосредственно влиять на давление крови в

крупных артериях. Кроме того, изменение давления в грудной полости приводит к изменению

просвета вен и тем самым влияет на приток крови к сердцу.

Нервные влияния на сердечно-сосудистую систему проявляются в виде среднечастотных

колебаний АД. Как правило, в среднечастотной области спектра артериального давления

наблюдается хорошо выраженный пик. Частота этих колебаний, называемых волнами Майера,

различается у разных видов животных: 0,4 Гц у крыс, 0,3 Гц у кроликов и 0,1 Гц у собак и людей.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Природа низкочастотных колебаний АД (у крыс - менее 0,2 Гц) наименее ясна. На спектре

системного артериального давления в низкочастотной области обычно не наблюдается четко

выраженных пиков. Это свидетельствует о том, что такие колебания могут быть обусловлены

активностью нескольких осцилляторов с близкими частотами. В этой частотной области проявляется

действие ренин-ангиотензиновой системы и миогенная активность сосудов, характерная прежде

всего для сосудов почек и брыжейки.

Методика поцикловой обработки первичных сигналов

Обработку данных проводят с помощью программного обеспечения Powergraph. Определение

значений параметров для каждого из последовательных сердечных циклов (под сердечным циклом

понимают совокупность процессов, происходящих за одно сокращение сердца и его последующее

расслабление) является наиболее информативным подходом к обработке зарегистрированных

сигналов параметров гемодинамики. Вычисление проводят с использованием программного

обеспечения Powergraph.

На записи кривой пульсовой волны определяют длительность индивидуальных сердечных

циклов (пульсовые интервалы - ПИ). За длительность ПИ принимают промежутки времени между

двумя пограничными точками. При анализе сигнала артериального давления для каждого сердечного

цикла вычисляют систолическое, диастолическое и среднее значение артериального давления, а

также его длительность (рисунок 7). Для этого путем последовательного дифференцирования кривой

находят точки, в которых первая производная принимает нулевые значения (максимумы и

минимумы, соответствующие систолическим и диастолическим значениям давления). Границами

индивидуальных сердечных циклов считают точки, в которых первая производная функции

артериального давления принимает максимальные значения (такие точки расположены на участках,

соответствующих фазе быстрого нарастания давления во время систолы). Значения среднего АД для

каждого сердечного цикла вычисляют как среднее арифметическое для всех точек, лежащих в

пределах данного цикла.

Затем рассчитывают значения частоты сердечных сокращений (ЧСС) для периодов наблюдения

заданной длительности.

Методика вычисления статистических показателей вариабельности

Статистические характеристики артериального давления или сердечного ритма вычисляют для

сравнительно длительных периодов регистрации (от 5 до 30 минут и более).

Часто вариабельность параметров оценивают по стандартному отклонению (СО),

вычисленному для выборки значений, соответствующих индивидуальным сердечным циклам:

____________

/ 2

/SUM (x - M)

/ i

СО = \/ -------------

, (3)

n - 1

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

где:

x - значение параметра для данного сердечного цикла;

i

M - среднее значение параметра, вычисленное для выбранного временного интервала;

n - количество сердечных циклов, зарегистрированных в течение этого времени.

Еще одной статистической характеристикой сигнала служит коэффициент вариабельности (КВ).

Он рассчитывается как:

СО

КВ = -- x

100%. (4)

M

Вычисление коэффициента вариабельности позволяет учесть различия в среднем значении АД

и ПИ между экспериментальными группами животных, индивидуальные различия между

животными в пределах экспериментальной группы, а также изменения параметров при

экспериментальных воздействиях наноматериалов.

Методика проведения спектрального анализа

Обработку данных проводят с помощью программного обеспечения MatLab. Принцип

спектрального анализа предполагает, что любой апериодический сигнал может быть представлен как

совокупность синусоидальных колебаний, различающихся между собой по амплитуде, частоте и

фазовому сдвигу. Спектральный анализ обычно выполняется с использованием математической

процедуры быстрого Фурье преобразования временного ряда. Отдельные частоты могут быть

сгруппированы в полосы для статистически более надежного оценивания.

Из-за нерегулярности сердечного ритма вычисленные значения пульсового интервала,

систолического, диастолического и среднего АД неравномерно распределены во времени. Поскольку

для вычисления спектра мощности необходимы значения, разделенные равными временными

интервалами, по экспериментальным данным путем линейной интерполяции вычисляют значения

параметров, отстоящие друг от друга на 0,1 сек. Далее весь исследуемый интервал (например, 30

мин.) разбивают на неперекрывающиеся отрезки длительностью 51,2 с (512 точек). При такой длине

анализируемых отрезков времени нижняя граница исследуемых частот составляет около 0,02 Гц, а

верхняя - 5 Гц.

На кривой давления, как правило, присутствуют линейные тренды, обусловленные

колебаниями, период которых больше 51,2 сек. Чтобы они не проявлялись на спектре мощности,

полученные ряды интерполированных значений (51,2 с) приводят к нулевому среднему путем

вычитания линейного дрейфа. Затем для каждого отрезка (51,2 сек.) вычисляют спектр мощности с

использованием быстрого преобразования Фурье. Отрезки, содержащие артефакты, связанные с

резкими движениями животного, исключают из анализа. Полученные спектры усредняют для всего

интервала наблюдения.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Суммарную интенсивность колебаний пульсового интервала в различных частотных

диапазонах вычисляют интегрированием найденной спектральной плотности. Диапазоны для

анализа выбирают в соответствии с данными литературы о временных характеристиках

кардиотропных регуляторных механизмов (таблица 5).

Таблица 5

Дата добавления: 2014-11-25