Осаждение нативных белков

СПОСОБЫ ОСАЖДЕНИЯ БЕЛКОВ

Свойства воды гидратной оболочки

а) Температура кипения выше 100⁰С.

б) Температура замерзания ниже 0^ОС.

в) В воде гидратной оболочки не растворяются различные соли и другие гидрофильные вещества.

г) Окружая каждую молекулу белка, гидратная оболочка не дает этим белковым молекулам сблизиться, соединиться и выпасть в осадок.

2) ЗАРЯД БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ. Поверхность большинства белковых молекул заряжена потому, что в каждой молекуле белка есть свободные заряженные СОО^- и NH₃⁺ группы. Изоэлектрическая точка (ИЭТ) большинства белков организма находится в слабокислой среде. Это означает, что у таких белков количество кислотных (СООН) групп больше количества основных групп (NH₃). рН плазмы крови около 7,36 - это выше ИЭТ большинства белков, поэтому в плазме крови белки имеют отрицательный заряд.

Делятся на две группы:

1) Способы осаждения нативного белка

2) Способы осаждения денатурированного белка

Чтобы осадить белок из раствора, надо лишить его обоих факторов стабилизации: и заряда, и гидратной оболочки.

Чтобы сохранить нативность белковой молекулы, ее заряд можно устранить только одним способом: приблизить рН среды к изоэлектрической точке белка (ИЭТ), а для большинства белков нашего организма ИЭТ находится в слабокислой среде. Другой фактор стабилизации - гидратную оболочку можно устранить разными способами.

Наиболее типичным примером осаждения нативного белка является ВЫСАЛИВАНИЕ.

а) ВЫСАЛИВАНИЕ - это осаждение белков высокими концентрациями нейтральных солей щелочных и щелочноземельных металлов, поскольку такие соли очень гидрофильны и обладают в высоких концентрациях водоотнимающими свойствами. Чаще это NaCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, CaCl₂. По мере добавления таких солей к раствору белка они сначала растворяюся в свободной воде, а затем, при дальнейшем повышении концентрации соли, конкурируют с белком за обладание водой, которая входит в состав гидратных оболочек. Белки менее гидрофильные, которые плохо удерживают воду гидратной оболочки, теряют ее раньше. Более гидрофильные белки требуют большей концентрации соли для высаливания. Поэтому с помощью высаливания можно разделить белки с разной степенью гидрофильности. Таким способом, например, можно разделить альбумины и глобулины плазмы крови.

При высаливании сохраняется нативность белковых молекул. Если осадить белки с помощью высаливания, а затем уменьшить концентрацию солей, например, методом диализа, то белок опять растворится.

Осаждения белков без потери ими нативности можно достичь также с помощью водоотнимающих средств.

б) ПРИМЕНЕНИЕ ВОДООТНИМАЮЩИХ СРЕДСТВ. Такими средствами являются растворители, которые смешиваются с водой в любых соотношениях. Чаще всего это ацетон, этиловый спирт. Эти вещества отнимают гидратные оболочки белков, и белки выпадают в осадок, если они лишены заряда. Но, в отличие от высаливания, осадок сразу (немедленно!) должен быть отделен от растворителя. Если растворитель и белок будут длительно находиться в контакте, то могут произойти необратимые изменения структуры белковой молекулы (денатурация).

Дата добавления: 2014-11-16