Высокотехнологические гематологические анализаторы

Подсчет и дифференциация лейкоцитов

Определение количества лейкоцитов возможно только после лизиса эритроцитов. Эта задача оказалась легко решаемой, т.к. свойства мембран эритроцитов и лейкоцитов существенно различаются. Эритроциты легко лизируются под воздействием многих поверхностно-активных веществ, при этом лейкоциты, хотя и претерпевают некоторые изменения, остаются целыми. Поэтому при подсчете лейкоцитов, прежде чем пропустить разведенную суспензию крови через апертуру датчика, к ней добавляют лизирующий раствор — эритроциты разрушаются до очень мелких фрагментов, которые при подсчете лейкоцитов генерируют электрические импульсы очень низкой амплитуды, не влияющие на результат анализа.

Разделение неизмененных лейкоцитов кондуктометрическим методом на основные субпопуляции невозможно ввиду близости их объемов, однако можно подобрать такую композицию растворителя и лизирующего раствора, то различные формы лейкоцитов претерпевают изменениярамеров в разной степени и, благодаря этому, могут разделяться данным методом. Изменение объема клетки зависит от многих факторов, включающих величину и форму ядра, объем цитоплазмы, наличие включений, а также особенности лизирующего реагента, поэтому размер трансформированных клеток не соответствует размерам клеток при визуальном просмотре их в окрашенном мазке крови.

Полученные после анализа лейкоциты распределяются на гистограмме следующим образом:

· Область малых объемов (35-90 фл) формируется лимфоцитми, которые под действием гемолитика значительно уменьшаются в объеме.

· Гранулоциты (нейтрофилы, базофилы и эозинофилы), напротив подвергаются незначительному уменьшению в объеме и расположены в области 120-400 фл.

· Между двумя пиками имеется зона так называемых «средних лейкоцитов» (90-120 фл), которая лучше всего коррелирует с моноцитами (по этой причине в некоторых анализаторах клетки в этой области указываются как моноциты — MON). Однако, учитывая тот факт, что коэффициент корреляции с моноцитами R=0,5−0,8 сравнительно невысок, более корректным является название параметра «средние лейкоциты» или «средние клетки» (MXD). Практически в область средних клеток попадают базофлы и эозинофилы.

Высокотехнологические гематологические анализаторы способны осуществлять дифференцированный счет лейкоцитов по 5 (5Diff) основным популяциям: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты, используя различные принципы дифференцирования клеток, оценивать наличие незрелых гранулоцитов, анализировать ретикулоциты и их субпопуляции, производить оценку стволовых гемопоэтических клеток и субпопуляций лимфоцитов. Многочисленные функции современных гематологических анализаторов стали возможны благодаря развитию новых технологий, которые различаются у разных фирм-производителей.

В анализаторахфирмы Beckman Coulter (LH500, LH750) (США) используется трехмерный анализ дифференцировки лейкоцитов (VCS-технология), который включает в себя одновременный компьютерный анализ клеток по объему (Volume), электропроводности (Conductivity) и рассеяности лазерного луча (Scatter).

Полученные по трем каналам данные с помощью электроники комбинируются и анализируются, в результате чего происходит распределение клеток по дифференцировочным кластерам и лейкоциты разделяются на пять основных популяций: лимфоциты, моноциты, нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Результатом отображения объемного графика на плоскости является лейкоцитарная скатерограмма, на которой каждый тип клеток имеет свою зону расположения.

В анализаторах серии Cell-Dyn для дифференцировки лейкоцитов применяется тенология MAPSS — Multi Angle Polarized Scatter Separation— мультипараметрическая система лазерного светорассеяния—регистрация интенсивности рассеяния клетками поляризованного лазерного луча под разными углами. Этот метод заключается в компьютерном анализе рассеянгия лазерного луча клетками крови. Рассеяние клеткой поляризованного лазерного луча под разными углами дает сведения о таких ее свойствах, как:

· размер клеток — для чего оценивается прохождение поляризованного лазерного луча под малым углом рассеяния (близким к 0˚);

· структура (степень сложности клеток) — оцениваются по анализу рассеяния поляризованных лазерных лучей, направленных под углом до 7˚;

· ядерно-цитоплазматическое соотношение — оцениваются по анализу рассеяния поляризованных лазерных лучей, направленных под углом до 10˚;

· оценка формы клеточного ядра — осуществляется благодаря анализу светорассеяния поляризованных лазерных лучей под углом 90˚;

· для оценки клеточной зернистости и дифференцировки эозинофилов используется оценка светорассеяния деполяризованного луча под углом в 90˚.

В приборах серии Technicon, Advia 120, 2120, Pentra DX 120 разработан принцип жидкостной цитохимии (измерение активности пероксидазы в лейкоцитах), который в сочетании с другими методами (кондуметрический, гидродинамическое фокусирование, оптическая абсорбция) позволяет проводить дифференцировку лейкоцитов. Использование пероксидазной реакции основано на различной ее активности в лейкоцитах. Эозинофилы и нейтрофилы имеют интенсивную пероксидазную активность, моноциты—слабую, в лимфоцитах она не выделяется.

Проточная цитохимическая техника включает регистрацию рассеянного и поглощенного светового луча. В лейкоцитарном канале после лизиса эритроцитов и стабилизации лейкоцитов происходит цитохимическая реакция, далее лейкоциты дифференцируются по двум признакам: размеру клеток, определяемому методом рассеяния лазерного луча, и пероксидазной активности — по поглощению клеткой светового потока. Дифференцировка базофилов от других гранулоцитов проводится в базоканале. Цитоплазма всех лейкоцитов, за исключением базофилов, подвергается лизису после обработки пробы специфическим лизатором. Затем в канале осуществляется измерение дисперсии лазерного света под углами 2−3˚ и 5−15˚, что позволяет различить клетки в зависимости от формы ядер.

Сравнивая информацию, получаемую с Perox- и Baso-каналов, компьютер осуществляет дифференцировку лейкоцитов на 5 основных популяций, а также сигнализирует в виде «флагов» о присутствии в крови активированных лимфоцитов, незрелых гранулоцитов, бластов, эритробластов.

В гематологических анализаторах серии ХТ и ХЕ фирмы Sysmex применяется метод проточной цитофлюориметрии с использованием флюоресцентного красителя полиметина. этот флюоресцентный краситель связывается с ДНК и РНК неизменных клеток, что позволяет использовать его как для дифференцировки лейкоцитолв по 5 параметрам (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты), так и для подсчета ретикулоцитов.

Анализ клеток присходит в проточной кювете при пересечении луча лазера с длиной волны 633 нм. После контакта лазерного луча с окрашенной клеткой происходит рассеяние последнего под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Данные сигналы улавливаются фотоумножителями и регистрируются в виде трех параметров:

1. Прямое светорассеяние (FSC) — отклонение лазерного луча под малым (до 10˚) углом, которое зависит от размера (объема, только при условии сферической формы частицы) и формы клетки.

2. Боковое светорассеяние (SSC) —отклонение лазерного луча под углом до 90˚, зависящее от рефлекторного индекса (или плотности) клетки и характеризующее сложность внутриклеточных структур.

3. Детекция специфического флюоресцентного сигнала (SFL), который регистрируется параллельно с боковым светорассеянием и позволяет судить о содержании РНК/ДНК в клетках.

На основани полученных сигналов все клетки распределяются по кластерам (зонам) в соответсвии с их размером, структурой и количеством ДНК. Таким образом, происходит дифференцировка лейкоцитов на 4 популяции: лимфоциты, моноциты, эозинофилы и нейтрофилы вместе с базофилами.

Разделение нейтрофилов и базофилов происходит в базоканале, где используется метод специфического химического лизиса, основанный на предварительной обработке лейкоцитов реактивом, осуществляющим лизис всех клеток, за исключением базофилов, с последующим дискриминантным анализом всех элементов по размеру и сложности структуры и количеству ДНК.

Приборы оборудованы каналом для выделения незрелых гранулоцитов и атипичных лимфоцитов.

Использование приборов с полным дифференцированным подсчетом лейкоцитов (5Diff) позволяет повысить точность диффернциального подсчета лейкоцитов, провести скрининг нормы и патологии, динамический контроль за лейкоцитарной формулой и резко сократить ручной подсчет лейкоцитарной формулы, оставляя примерно до 15-20% образцов крови для световой микроскопии.

Дата добавления: 2014-11-16