Флуоресцентна мікроскопія

Флуоресцентна мікроскопія — метод отримання збільшеного зображення з використанням люмінесценції збуджених атомів та молекул зразка. В флуоресцентному мікроскопі зразок опромінюється світлом із більшою частотою, а зображення отримують на іншій, меншій частоті. Випромінювання зразка, відповідно, пропускається через фільтр, що відсікає світло на частоті збудження.

Одним із видів флуоресцентної мікроскопії є конфокальна мікроскопія, метод, що дозволяє отримати зображення із певної глибини в середині зразка. Простіший метод, за допомогою якого можна досліджувати поверхню, називають епіфлуоресцентною мікроскопією. Різниця між звичайним світловим і флуоресцентним мікроскопом полягає в тому, що в ньому пренарат розглядається у світлі, випромінюваному самим препаратом під час опромінення його ультрафіолетовими променями. У той час як збуджуючі флуоресценцію ультрафіолетові промені невидимі для ока, вдруге виникають в об'єкті промені мають довшу хвилю і відносяться до видимої частини спектру. Тому при спостереженні в флуоресцентному мікроскопі видно на темному полі різноманітне світіння частин об'єкта. Після припинення опромінення препарат у мікроскопі невидимий. Препарати, що розглядаються в флуоресцентний мікроскоп, представляються різноманітно і живописно забарвленими. Окремі ділянки препарату, окремі волокна і клітини в залежності від їх хімічного складу флуоресцируют різному. Колір н інтенсивність флуоресценції дозволяють відрізнити один від одного деталі різної природи. За допомогою флуоресцентного мікроскопа вдається виявити нові деталі структури, невидимі при звичайному освітленні, і диференціювати елементи тканин різної природи. У ряді ж випадків безпосередньо за кольором флуоресценції можна визначити природу речовини.

Флуоресцентний мікроскоп по суті являє собою звичайний мікроскоп, до якого додається дугова лампа, яка служить джерелом ультрафіолетових променів. Лампа забезпечена колектором і фільтротримачем. Бо частину ультрафіолетових променів, які висвітлюють об'єкт, що не абсорбується останнім і може заважати мікроскопії, то для усунення цього явища в окуляр вставляється особливий фільтр, який поглинає ультрафіолетові промені. У фільтродержатель поміщається «фільтр Вуда» – чорне скло, яке пропускає ультрафіолетові промені (4000-3200А) і затримує майже всі промені видимого спектру, однак пропускає червоний колір з довжиною хвилі більше 6500А. Ці промені є в деякій кількості в спектрі випромінювання ртутної дуги, але їх значно більше в спектрі випромінювання вугільної дуги. Для усунення довгохвильового випромінювання застосовують другий фільтр – 2,5-5-процептний розчин сірчанокислої міді.

Об'єктиви і окуляр флуоресцентного мікроскопа можуть бути зроблені зі звичайного оптичного скла, оскільки тут спостереження ведеться вже у видимому світлі. Можна користуватися сухими і імерсійними об'єктивами. Роботи з мікроскопом ведуться в затемненій кімнаті з вентилятором для усунення шкідливих газів від джерела освітлення.

Лампа, застосовувана при флуоресцентної мікроскопії, дає порівняно довгі ультрафіолетові промені (300-400 ту.), Які відносно слабо абсорбуються склом. Це дозволяє користуватися звичайним конденсором і звичайними предметними і покривними стеклами, не вдаючись до кварцового конденсорі і кварцовим предметним і покривним стеклам. В якості середовища для укладення препаратів застосовують воду, фізіологічний розчин кухонної солі, гліцерин, нефлуоресцірующіх парафінова олія.

Для іммерсіі слід вживати нефлуоресцірующіх іммерсійне масло.

За допомогою флуоресцентної мікроскопії можна досліджувати також об'єкти, що володіють власною флуоресценцією, тобто випромінюють видимі світлові промені під впливом ультрафіолетових без будь-якої спеціальної обробки. Такий власної флуоресценцією володіє ряд речовин, наприклад, А і ВГ канцерогенні речовини і т. п. Вторинною флуоресценцією називають світіння, що виникає в об'єкті, зазвичай флуоресціюючому тільки після обробки його речовинами, що володіють інтенсивної флуоресценцією, наприклад, особливими барвниками.

Дата добавления: 2014-11-20