Методи негативного контрастування і кріоелектронної мікроскопії

Методи електронної мікроскопії: замороження-скалування і замороження.

Методи електронної мікроскопії: замороження-скалування і замороження. Методи негативного контрастування і кріоелектронної мікроскопії. Ядерний магнітний резонанс (ЯМР). Розмноження клітин і їхнє культивування. Вирощування клітин в культуральному середовищі. Вивчення клітинних макромолекул за допомогою антитіл і радіоактивних ізотопів. Гібридизація.

У клітинній біології особливо успішно використовуються два методи, засновані на одержанні механічних реплік.

Один з них - метод електронної мікроскопії «заморожування-сколювання» - дає можливість вивчати внутрішню будову клітинних мембран. Клітки заморожують при температурі рідкого азоту. Заморожений блок потім розколюють лезом ножа. Відкол часто проходить через гідрофобну середину подвійного шару ліпідів, оголюючи внутрішню поверхню клітинних мембран. Утворену поверхню відколу, яка утвориться відтіняють платиною, органічний матеріал видаляють і вивчають отримані репліки в електронному мікроскопі.

Метод «заморожування - травлення» використовується для вивчення зовнішньої поверхні кліток і мембран. У даному випадку клітки заморожують при дуже низькій температурі і замороженому блоці розколюють лезом ножа. Вміст льоду навколо кліток (і в меншому ступені усередині кліток) знижують сублімацією води у вакуумі при підвищенні температури (процес називають вакуумним сушінням). Ділянки клітини, піддані такому травленню, потім відтіняють для готування платинової репліки.

Використовуючи для контрастування відтінення солями важких металів, можна спостерігати в електронний мікроскоп ізольовані макромолекули, наприклад, ДНК або великі білки, а після негативного контрастування можна розгледіти навіть дрібні деталі. При готуванні зразків для негативного контрастування досліджувані молекули наносять на тонку плівку вуглецю (практично прозору для електронів), потім її змочують концентрованим розчином солей важких металів, наприклад, уранілацетата. Після висушування зразка тонка плівка солей важких металів рівномірно покриває вуглецеву підкладку, за винятком ділянок, зайнятих адсорбованими макромолекулами. Речовина макромолекул більш проникна для електронів у порівнянні з ближніми ділянками, покритими солями важких металів; за рахунок цього виникає звернене або негативне зображення молекули.

В даний час можна спостерігати з високим дозволом навіть внутрішні деталі тривимірних структур, таких, як віруси. Для цього використовують метод кріоелектроної мікроскопії, де дуже тонкий (приблизно 100 нм), швидко заморожений шар вологого зразка поміщають на мікроскопічні ґрати. За допомогою спеціального пристосування гідратований зразок утримують при - 160сС у вакуумі мікроскопа. Таким способом можна спостерігати матеріал практично безпосередньо: без фіксації, фарбування і сушіння.

Кріоелектрона мікроскопія — підвид електронної мікроскопі (ЕМ), де зразок, що досліджується, охолоджують до кріогенних температур (зазвичай, температури рідкого азоту). Кріо-ЕМ дуже популярна в галузі структурної біології. Різновидом кріо-ЕМ є кріоелектронна томографія (КЕТ), в якій отримується тривимірна структура зразку за допомогою обчислювального аналізу серії двовимірних проекцій, знову отриманих за кріогенними температурами.

Я́дерний магні́тний резона́нс — це явище резонансного поглинання радіочастотних хвиль деякими ядрами атомів, що розміщені у зовнішньому магнітному полі. Найчастіше ЯМР досліди проводять на ядрах атомів водню, тобто на протонах, або на ядрах ізотопу вуглецю 13С. На базі ЯМР була розвинута ЯМР-спектроскопія, що дозволяє з великою точністю розрізняти ядра елемента за їхніми властивостями в різному оточенні в молекулі.

Ядерний магнітний резонанс також знайшов широке застосування в фізиці, біології, медицині, неруйнівному контролі та індустрії. За допомогою ЯМР можна вивчати взаємодію між ядерними магнітними моментами, а також магнітну взаємодію ядер з електронними спінами і орбітальними магнітними моментами. Аналіз ЯМР-спектрів використовується для визначення структури і складу хімічних сполук. Відкриття ЯМР спричинило революцію в методах ідентифікації органічних сполук. Поряд з методом дифракції рентгенівських променів ЯМР використовують для встановлення структури біологічних макромолекул. Цей метод стає особливо важливим коли досліджувана речовина знаходиться в розчині і її не можливо кристалізувати. Побудована на базі ЯМР магнітно-резонансна томографія широко використовується в медицині для дослідження внутрішніх органів і біологічних тканин. За допомогою сучасної ЯМР техніки, що працює в магнітних полях розсіяння, проводяться підповерхневі дослідження. Це дає змогу контролювати процеси виготовлення бетону, сушіння деревини, перевіряти якість автомобільних шин. ЯМР також використовується для дослідження геологічних порід і пошуку нафти та природного газу.

Дата добавления: 2014-11-20