Окрашивание по цилю-нильсену

Реактивы.

1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина (0,3г основного фуксина растереть в ступке с 2-3 каплями глицерина, добавить по каплям 10мл 96% этилового спирта).

2. Рабочий раствор фенола - 5% водный раствор (расплавить 5г кристаллического фенола путем легкого подогревания на водяной бане, добавить слегка подогретую дистиллированную воду до объема 100мл).

3. Рабочий раствор карболового фуксина (в 90мл рабочего раствора фенола добавить 10мл насыщенного раствора фуксина), хранится не более 2-х недель.

4. Обесцвечивающие растворы:

а) раствор серной кислоты (к 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл концентрированной серной кислоты) или

б) раствор солянокислого спирта (к 97 мл спирта осторожно добавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты).

5. Рабочий раствор метиленового синего (растворить 0,3г хлорида метиленового синего в 100мл дистиллированной воды).

Ход окраски. Перед окраской необходимо убедиться, что подготовленные мазки фиксированы и промаркированы. Препараты помещают на подставку («рельсы») так, чтобы они не касались друг друга, и расстояние между ними составляло порядка 1см, а маркировка (номер) была направлена в одну сторону. На каждое стекло накладывают полоску фильтровальной бумаги так, чтобы она полностью закрывала мазок. Это делают для того, чтобы краска не разливалась по стеклу. Одновременно за счет использования фильтровальной бумаги предотвращается осаждение на мазок кристаллов краски, которые при микроскопическом исследовании могут быть ошибочно приняты за кислотоустойчивые микобактерии. Наливают на бумагу раствор карболового фуксина с избытком и нагревают препарат над пламенем горелки до легкого появления паров. При подогревании препарата следят за тем, чтобы краска не закипела, а фильтровальная бумага не высыхала. Подогретый мазок оставляют на 5 минут, чтобы краситель проник в клеточную стенку микобактерий и окрасил ее. Пинцетом снимают и удаляют фильтровальную бумагу, осторожно смывают остатки краски слабой струей дистиллированной воды до тех пор, пока не прекратится видимое отхождение краски. При промывании мазков используют холодную воду или воду комнатной температуры. Перед тем, как нанести на стекло следующий раствор, щипцами или пинцетом берут каждое стекло за маркированный конец и наклоняют, чтобы с него стекла вода - это предотвращает разбавление следующего реактива.

Мазок обесцвечивают 3 минуты одним из обесцвечивающих растворов, полностью покрывая всю поверхность мазка, тщательно промывают его дистиллированной водой и докрашивают в течение 1 минуты, не превышая экспозицию, 0,3% раствором метиленового синего. Вновь аккуратно промывают проточной водой, наклоняя каждое стекло, чтобы стекала вода, высушивают на открытом воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении.

При окраске карболовым фуксином микобактерии туберкулеза выявляются в виде тонких, слегка изогнутых палочек малиново-красного цвета, которые могут располагаться поодиночке, парами, группами, в вид римской буквы «V». Они хорошо выделяются на синем фоне, в который окрашиваются остальные элементы мокроты.

Препарат исследуют с масляной иммерсией в световом микроскопе (объектив 100Х, окуляр 10Х).

Количество КУМ при микроскопическом исследовании является очень важным показателем, так как характеризует степень эпидемической опасности больного и тяжесть заболевания. Поэтому микроскопическое исследование должно быть не только качественным, но обязательно и количественным. Следует просматривать не менее 100 полей зрения, чтобы дать количественную оценку препарату и обнаружить единичные микобактерии. В том случае, если результат такого исследования оказывается отрицательным, для подтверждения просматривают дополнительно 200 полей зрения. При значительном количестве кислотоустойчивых микобактерий достаточно исследовать 20-50 полей зрения. Критерии оценки результатов микроскопии приведены в таблице 20.

Таблица 20

Оценка результатов микроскопического исследования на КУМ

при окраске по Цилю-Нильсену

Результат исследования	Минимальное число полей зрения (п/з), обязательных для просмотра	Форма записи результата	Интерпретация результата исследования
КУМ не обнаружены в 300 п/з		ОТР	Отрицательный
1-2 КУМ в 300 п/з		Рекомендуется повторить исследование	Результат не оценивается
1-9 КУМ в 100 п/з		«____» КУМ в 100 п/з *	Положительный
10-99 КУМ в 100 п/з		1+	Положительный
1-10 КУМ в 1 п/з		2+	Положительный
Более 10 КУМ в 1 п/з		3+	Положительный

* Точное число - единичные КУМ в препарате;

1+ - единичные КУМ в поле зрения;

2+ - умеренное количество КУМ;

3+ - значительное количество КУМ.

В специализированных противотуберкулезных учреждениях для выявления КУМ применяется также метод люминесцентной микроскопии, основанный на свечении микобактерий туберкулеза, окрашенных ауромином, в ультрафиолетовых лучах.

7.3.5. Контрольные вопросы по теме «Микроскопическое и бактериоскопическое исследование мокроты»

1. Какое диагностическое значение имеет обнаружение лейкоцитов в мокроте?

2. Как можно обнаружить спирали Куршмана в мокроте?

3. Из чего образуются кристаллы Куршмана?

4. Какие клеточные элементы выявляются в нативном препарате мокроты?

5. Виды альвеолярных макрофагов.

6. При каком патологическом процессе в мокроте появляются эластические волокна?

7. Какой реакцией выявляют «клетки сердечных пороков»?

8. Приготовление мазка мокроты для выявления КУМ.

9. Какой вид имеют микобактерии туберкулеза при окраске по Цилю-Нильсену?

10. Как оценивают результат микроскопического исследования мокроты на КУМ?

Дата добавления: 2014-11-29