Экспериментальная часть. Дополнительная литература

Дополнительная литература

4.2.1. Спектроскопические методы исследований в физиологии и биохимии. – Л.: Наука, 1987. – 204 с.

4.2.2. Физико-химические методы молекулярной биологии. – М.: Изд-во Моск. ун-та., 1978. – С. 65 – 95; 127 –173.

4.2.3. Бурштейн Э. А. Люминесценция белковых хромофоров. – М.: ВИНИТИ «Итоги науки и техники». Серия БИОФИЗИКА. – Т. 6, 1976. – 216 с.

4.2.4. Черницкий Е. А. Люминесценция и структурная лабильность белков в растворе и клетке. – Минск.: Наука и техника, 1972. – 280 с.

4.2.5. Эккерт Р. и др. Физиология животных. – М.: Мир, 1991. – Т. 1. Фоторецепторы. – С. 239 – 250.

4.2.6. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. – М.: Мир, 1986. – 496 с.

4.3.1. Инструкция по эксплуатации фотоэлектроколориметра = ФЭКа, модели КФК-2

1. За 15 мин. до начала фотометрии, под контролем лаборанта или преподавателя, дежурный убеждается, что стрелка гальванометра находится в положении «механический 0», открывает крышку кюветного отделения прибора, вставляет его вилку в сетевую розетку и, тумблером на задней панели слева, включает прогрев ФЭКа.

2. Перед началом измерений, вращая рукоять светофильтра, на передней панели прибора слева, установить нужный диапазон светового потока = пучка.

3. Убедиться, что рукоять чувствительности прибора на передней панели справа, соответствует цветовому диапазону рукояти светофильтра.

4. Подготовить фотометрические кюветы нужной толщины, насухо протереть марлевой салфеткой их оптические грани и, убедиться в отсутствии на них пятен и др. грязи. ВНИМАНИЕ! Поскольку каждый ФЭК оснащен лишь одним набором кювет, изготовленных из полированного оптического стекла, пользоваться ими можно лишь над рабочим столом и брать рукой, только за боковые грани, оберегая от царапин и ударов.

5. Убедиться, что стрелка включенного гальванометра находится в положении «электрический 0».

6. Заполнить контрольную кювету дистиллятом или, указанным в соответствующей методике контрольным раствором, убедиться в отсутствии капель и потеков на ее оптических гранях, строго вертикально вставить ее в дальнее гнездо кюветодержателя и, рукояткой в центре передней панели ФЭКа, до упора ввести кювету в световой пучок.

7. В соответствии с п. 6, заполнить вторую кювету исследуемым раствором и вставить ее в свободное гнездо кюветодержателя, примерно на том же расстоянии от источника света. ВНИМАНИЕ! При анализе серии однотипных образцов, избегая излишних промывок кюветы, начинать фотометрию с наиболее разбавленных проб.

8. Закрыть крышку кюветного отделения до звяка шторки и, вращая на передней панели вверху рукояти грубой, а затем и тонкой настройки, установить стрелку гальванометра на 0 шкалы D = А. ВНИМАНИЕ! При положении стрелки между делениями шкалы - округлять цифру до целого значения.

9. Не открывая крышки кюветного отделения, переместить до упора рукоять кюветодержателя в противоположение, заменив тем самым в световом потоке, контрольную кювету исследуемой.

10. Убедиться, что стрелка гальванометра успокоилась и занести показания ФЭКа в протокол опыта.

11. Открыть крышку кюветного отделения, вынуть из кюветодержателя кювету с исследуемым раствором и, декантировать ее содержимое обратно в соответствующую пробирку. ВНИМАНИЕ! Для последующих измерений, во избежание потеков на стенках, кювету не переворачивать, а удерживая вверх дном, осушить ее торец фильтровальной бумагой.

12. При последующих измерениях, руководствоваться пп. 6-11 данной инструкции.

4.3.2. Определение концентрации гемоглобина (Hb) в крови

гемиглобинцианидным методом

Принцип: Основный буферный раствор разрушает эритроциты, а феррицианид калия K₃[Fe(CN)₆] = красная кровяная соль, окисляет до трёхвалентного состояния атом Fe²⁺ гема гемоглобина = Нb. Возникший гемиглобин (Нi), или, по старой номенклатуре - метгемоглобин, реагирует с ацетонциангидрином:

с образованием гемиглобинцианида, имеющего стабильный максимум абсорбции при λ 540-546 нм, пропорциональный содержанию Hb в пробе. Метод общепринят в мировой лабораторной прак-тике, как наилучший по сочетанию параметров. Нормальное содер-жание Нb в крови женщин составляет: 115 – 145 г/л, а мужчин: 132 – 164 г/л. Выпускаемые промышленностью моделигемоглобинометров, обычно основаны на том же принципе фотометрии, но имеют суженный диапазон, соответствующий максимуму А гемиглобинцианида.

Ход определения: В маркированную пробирку внести точно 5 мл трансформирующего раствора, содержащего нужные пропорции буфера, феррицианида калия и ацетонциангидрина. Затем, с помощью полуавтоматического дозатора, туда же добавить 20 мкл крови (Разведение в 251 раз). Полученной смесью многократно промыть наконечник дозатора и тщательно перемешать раствор. Пробирку оставить в штативе не менее чем на 10 мин.

Декантировать пробу в кювету ФЭКа, толщиной 10 мм и при зеленом светофильтре, против трансформирующего раствора, измерить А. Рассчитать концентрацию гемоглобина (г/л) в крови по формуле: А ^. 367,7, занести результат в протокол и сделать выводы.

4.3.3. Определение количества эритроцитов в крови с помощью турбидиметрии

Принцип метода: Многократное разведение нативной крови с антикоагулянтом, изоосмотическим раствором с физиологическим рН, делает суспензию эритроцитов относительно стабильной и прозрачной. Это позволяет, при максимально возможной λ ФЭКа, сочетать минимум поглощения энергии света с его максимальным рассеянием, клетками соизмеримого диаметра.

Ход определения:

1. Подготовить в штативе ряд из 7 маркированных пробирок.

2. С помощью мерных пипеток, внести в первую пробирку точно 4 мл, а в остальные – по 2 мл 0,85 % раствора хлорида натрия = физиологический раствор, с рН = 7,36.

3. Полуавтоматическим дозатором на 20 мкл внести в первую пробирку 2 объема (40 мкл) цельной крови. Многократно промыть наконечник дозатора полученной суспензией, тщательно перемешивая ее.

4. С помощью мерной пипетки, перенести из первой пробирки во вторую точно 2 мл суспензии и снова, тщательно ее перемешать.

5. Повторять операцию «переката», перенося точно по 2 мл суспензии и тщательно перемешивая вновь полученную, из второй пробирки в третью, из третьей в четвертую и т.д. Из последней пробирки, 2 мл суспензии слить в отходы.

6. Вращая рукоять на передней панели ФЭКа слева, установить красный светофильтр и, соответственно пп. 2 и 3 работы 4.3.1, убедиться в соответствии положения рукояти его чувствительности на передней панели справа.

7. Начиная с самой разбавленной пробы (пробирка 7) поочередно декантировать содержимое пробирок в кювету толщиной 5 мм и, замерив их абсорбцию против дистиллята или физраствора, занести результаты в таблицу 4.4 протокола опыта.

Таблица 4.4

Анализ серии растворов

8. Рассчитать серии разведений крови, полученных методом «переката».

9. Вычертить график зависимости между разведением проб (абсцисса) и абсорбцией (ордината), определив на нем линейный отрезок разведений, пригодных для счета эритроцитов по степени мутности растворов.

10. Если параллельно, с помощью эталонной микроскопии в камере Горяева, подсчитать содержание эритроцитов в исходном образце крови и разведенных пробах, можно заполнить последнюю строку в таблице 4.4. Соответственно, внеся нужные поправки, удастся построить аналогичный разбавлению калибровочный график, таблицу или простую компьютерную программу, для автоматического счета эритроцитов в разбавленных образцах крови. В частности, так построена калибровочная таблица лаборатории, по которой можно определить содержание эритроцитов в 1 мкл и, соответственно, в 1 л крови исследуемого образца.

11. Сделать выводы из эксперимента, учитывая, что нормальное содержание эритроцитов в крови женщин: 3 – 4,5 ^х 10¹²/л, а мужчин: 4 – 5,5 ^х 10¹²/л.

12. Пара студентов, завершающая фотометрию, оставив открытой крышку кюветного отделения ФЭКа, тумблером на задней панели слева, выключает прибор и вынимает его сетевую вилку из розетки.

13. Слив растворы из кювет, тщательно вымыть их изнутри и снаружи дистиллятом и, оставить вверх дном на фильтре. После чего, убрать рабочее место и сдать его лаборанту.

Дата добавления: 2014-12-27